高比表面積阿魏酸多孔淀粉酯結構表征及體外消化特性

茍麗娜，馬云翔，王宇霞，李敏，陳金鳳，汪月，張盛貴

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)

阿魏酸(ferulic acid，FA)作為分布最廣泛的天然酚類植物化學物質，多與木質素及多糖共價連接構成種子、葉片的部分細胞壁，普遍存在于蔬菜、水果、中草藥及谷物種子中[1-2]，由于其具有抗炎、抗病毒、抗過敏、抗癌、神經保護和抗血栓等[3-4]多種生物和藥理活性，在食品及醫藥領域內引起了極大的關注?；诨瘜W結構中苯環上羥基以及供電子體甲氧基的鄰位取代，從而具備苯氧自由基穩定性[5]，FA被證實是一種有效的抗氧化劑，其抗氧化活性包括清除自由基以及防止自由基鏈反應和脂質過氧化[6]。然而FA化學結構中苯環和短不飽和烴鏈的存在導致了低極性和低水溶性，使其難以滲透脂質雙分子層，限制了其體內抗氧化作用[4]。但是，通過與淀粉、殼聚糖等生物可降解材料發生酯化或醚化反應進行化學修飾，可增強FA的水溶性和生物利用度[7-8]。

淀粉具備成本低廉、安全性、生物相容性、可降解性及化學惰性等優點，可作為理想的活性物質遞送載體。但是，天然淀粉(native starch，NS)顆粒有限的比表面積和孔體積，限制了其在吸附和轉運目標化合物方面的應用潛力。多孔淀粉(porous starch，PS)是一種通過化學、物理或酶處理后，淀粉顆粒表面及內部形成納米級多孔微結構的改性淀粉。多孔結構提供的大的比表面積、高孔體積和低密度使PS具備強吸附性。在食品、醫藥工業中，PS已被用于不同活性物質的遞送制劑，如改善疏水性活性劑溶解性、靶向藥物遞送、疏水性藥物的吸附等[9]。SOLEIMANPOUR等[10]研究發現將水溶性差的植物雌激素染料木黃酮裝載到PS中，可顯著提升植物雌激素的溶解性、穩定性和生物利用度，其高吸附容量顯示了多孔淀粉作為活性劑載體的潛在優勢。

通過酯化、醚化、交聯和接枝等衍生化反應將特定的官能團引入淀粉分子是最常見的淀粉化學改性方法[11-12]，其中淀粉酯是食品和非食品應用中最重要的淀粉衍生物之一。NS特殊的半結晶結構，使得試劑難以滲透到顆粒中，導致反應效率較低[13]。相比NS，以PS作為反應主體，試劑分子滲透入孔隙、孔道和空腔中，淀粉內部暴露出更多的反應位點與客體分子發生反應，提高反應效率，進而獲得更高的取代度。本團隊先前研究表明，相同條件下辛烯基琥珀酸酐酯化改性多孔淀粉較天然淀粉的取代度更高[14]。

盡管已有阿魏酸酯化改性淀粉的研究但尚未見阿魏酸對多孔淀粉酯化改性的報道。本研究以天然馬鈴薯淀粉為原材料，制備納米級孔徑的PS，在有機體系中使FA與PS酯化，構建高取代度且具備大量孔隙結構的阿魏酸多孔淀粉酯(ferulic acid porous starch ester，FA-PS)，對FA-PS的結構性能進行表征，并研究其體外消化特性，旨在為淀粉的綜合利用提供理論依據，且為改性淀粉作為潛在的活性物質吸附劑和功能性遞送載體材料提供一個有吸引力的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

天然馬鈴薯淀粉、阿魏酸、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、氯化亞砜、吡啶、無水乙醇、2,2-二苯基-1-苦肼基(DPPH)、胰酶、淀粉葡糖苷酶(AMG，100 000 U/mL)及其他試劑均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司；DMSO-d6(純度≥99.9%)，由劍橋同位素實驗室提供。

1.2 儀器與設備

HCJ-4D型恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州市瑞華儀器制造有限公司；ASAP 2020型全自動比表面積及孔隙度分析儀，美國麥克公司；NEXUS-670型傅立葉紅外光譜儀，美國Thermo公司；UV-2550型紫外可見分光光度計，日本Shimadzu公司；JSM-6701F型冷場發射型掃描電子顯微鏡，日本電子光學公司；X′Pert-Pro MPD型多晶粉末X射線衍射儀，荷蘭PANalytical公司；AVANCE III HD 400 MHz型超導核磁共振波譜儀，瑞士Bruker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 馬鈴薯多孔淀粉的制備

參考CHANG等[15]的方法并改進，稱取15 g馬鈴薯淀粉加入100 mL蒸餾水中，40 ℃磁力攪拌40 min 使其均勻分散，升溫至90 ℃并持續攪拌60 min 使淀粉完全糊化，自然冷卻至室溫后置4 ℃冷藏48 h以獲得淀粉凝膠，將淀粉凝膠切成立方體小塊(0.6～0.8 cm3)，在室溫下經5次乙醇置換后熱風干燥(50 ℃，6 h)，研磨備用。

1.3.2 FA-PS的制備

參考李顏利[16]、MATHEW等[17]的方法并改進，采用一步法合成FA-PS，具體操作如下：

稱取一定量FA至100 mL三口燒瓶，加入40 mL二氯甲烷磁力攪拌使其分散均勻，將與FA等摩爾量的氯化亞砜稀釋在10 mL二氯甲烷中，在N2保護下逐滴滴入三口瓶中，之后升溫至80 ℃回流反應4 h，停止反應。反復蒸餾除去過量的氯化亞砜和溶劑，得到阿魏酰氯。

將一定量PS分散在DMSO中，加入得到的阿魏酰氯中，以相對酰氯2∶1的摩爾比加入吡啶，在N2保護下80 ℃磁力攪拌狀態連續回流反應3 h，待反應液冷卻至室溫，邊攪拌邊緩慢加入無水乙醇(300 mL×3)析出沉淀物，離心除去上清液，收集固體，用無水乙醇索氏抽提36 h，真空冷凍干燥48 h，研磨后過100目篩備用。

1.3.3 取代度(degree of substitution，DS)測定

DS的測定和計算參考NAMAZI等的方法[18]。稱取一定量樣品于核磁管中，加入DMSO-d6，并超聲30 s使溶解充分并去除溶解氧對實驗的影響，使用核磁共振波譜儀TXISz探針掃描測定，溫度25 ℃。

在1H核磁共振圖譜中，5.11處的峰為脫水葡萄糖單元(anhydro glucose unit，AGU)中的質子(H1)信號，阿魏?；溕霞籽趸?—OCH3)端的質子信號峰在3.83處。由3.83處的質子峰面積與5.11處質子峰面積關系，可通過公式(1)計算樣品DS：

DS=(Asignal/Nsignal)/(AAGU/NAGU)

(1)

式中：Asignal、Nsignal，分別是樣品在3.83處的峰面積、質子數；AAGU、NAGU，分別是樣品在5.11處的峰面積、質子數。

1.3.4 N2-吸附/脫附等溫線測定

利用Micromeritics ASAP 2020系統測定樣品的N2-吸附/脫附等溫線。測量前先將樣品置于120 ℃下真空脫氣8 h，除去樣品表面吸附的氣體分子和殘余的溶劑。利用非定域密度泛函理論，從吸附數據中得到孔徑的尺寸分布曲線。樣品的比表面積依據Brunauer-Emmett-Teller(BET)多層吸附理論計算。

1.3.5 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)表觀形態觀察

用無水乙醇將少量樣品粉末分散在樣品座上，將樣品座置于離子濺射儀中鍍金60 s后，用掃描電子顯微鏡在不同放大倍數下觀察樣品的形態特征。

1.3.613C交叉極化/魔角旋轉固體核磁共振(13C cross polarization/magic angle spinning nuclear magnetic resonance，13C CP/MAS NMR)光譜測定

使用400 MHz超導核磁共振波譜儀，在發射機頻率為100.56 MHz下以四甲基硅烷的13C化學位移為參照測定樣品粉末的13C CP/MAS NMR光譜。

1.3.7 傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)測定

樣品的紅外光譜測定采用溴化鉀壓片法。取適量溴化鉀加入1 mg干燥至恒重的樣品粉末混合均勻，碾磨至均勻無顆粒感后壓片處理，在4 000～500 cm-1波數范圍內進行掃描測定。

1.3.8 X射線衍射(X-ray diffraction，XRD)光譜測定

采用X射線衍射儀對樣品粉末在5～35°范圍內進行連續掃描測定。

1.3.9 自由基清除活性測定

參照BRAND-WILLIAMS等[19]的方法稍做修改，使用DPPH測定樣品粉末的自由基清除活性。分別稱取1、3、5、7、9、11、13 mg(干基)樣品粉末于10 mL試管中，加入2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液4 mL，漩渦振蕩2 min，在室溫黑暗條件下靜置30 min后離心10 min(7 000 r/min)取上清液，以乙醇為空白對照，在517 nm處測定吸光值。DPPH自由基清除率可通過公式(2)計算：

(2)

式中：A0，為空白樣吸光值；A1，樣品吸光值；A2，乙醇溶液代替DPPH溶液所測吸光值。

1.3.10 水溶性的測定

為檢測樣品水溶性，稱取30 mg樣品粉末通過溫和攪拌將溶于5 mL蒸餾水中30 min，觀察溶解情況，在4 ℃冰箱中貯存24 h后離心并觀察樣品在水中的不同溶解情況及是否有沉淀物。

1.3.11 體外消化率測定

樣品的體外消化率測定參考LEE等[20]的方法稍做修改，稱取1 g胰酶分散在12 mL蒸餾水中10 min后以1 500 r/min離心10 min，取10 mL上清液與0.2 mL淀粉葡糖苷酶和1.8 mL蒸餾水混合(酶液現配現用)。將一顆玻璃小球(直徑5 mm)與30 mg樣品加入試管，然后加入pH為5.2的乙酸鈉緩沖液4.5 mL，在37 ℃恒溫水浴鍋中恒溫10 min，然后將1.5 mL酶溶液加入樣品管中，在37 ℃和150 r/min 振蕩水浴中水解20和120 min時，分別取水解液1 mL加入離心管，沸水浴5 min滅酶，離心10 min(1 500 r/min)后取上清液，采用DNS比色法，測定產生的游離葡萄糖含量。樣品中的淀粉含量為淀粉水解液中還原糖含量乘以葡萄糖折算系數0.9。各類淀粉含量可通過公式(3)、公式(4)、公式(5)計算：

(3)

(4)

抗性淀粉含量/%

=(1-快消化淀粉含量-慢消化淀粉含量)×100

(5)

式中：FG，原始樣品中游離葡萄糖的含量，mg；G20、G120，分別是消化20、120 min后釋放的葡萄糖的含量，mg；m，每次實驗所用的樣品質量，mg。

1.4 統計分析

每組實驗均重復測定3次，采用SPSS 19及Origin 8進行數據統計分析處理，結果以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 多孔淀粉的孔結構表征

2.1.1 多孔淀粉N2-吸附/脫附分析

為研究PS的孔結構特性，對N2-吸附/脫附等溫線數據進行分析。國際純粹與應用化學聯合會根據孔徑大小將孔隙分為三大類：微孔(<2 nm)、介孔(2～50 nm)、 大孔(>50 nm)，根據國際純粹與應用化學聯合會分類，PS的N2-吸附/脫附等溫線對應為IV型[21]，如圖1-b所示，表現出典型的毛細冷凝滯后回線，滯后環陡峭狹窄，出現在0.5～1.0 (P/P0)的相對高壓范圍內，這與毛細管冷凝機制對介孔結構孔的填充和排空有關。而圖1-a中NS的N2-吸附/脫附等溫線中并未觀察到毛細冷凝滯后回線，表明PS具備介孔結構。

a-天然馬鈴薯淀粉; b-多孔淀粉

為進一步表征制備材料的孔徑，采用Barret、Joyner和Halenda(BJH)方法計算孔隙分布，如圖2-a所示，PS的平均孔徑為20.23 nm，位于介孔材料孔徑分布(2～50 nm)范圍內，驗證制備的PS可歸屬于介孔材料范疇。圖2-b、圖2-c中利用Brunauer Emmett Teller(BET)模型計算出NS的比表面積僅為0.02 m2/g， 而PS的比表面積達到67.74 m2/g。

a-多孔淀粉孔徑分布圖; b-天然馬鈴薯淀粉BET表面積圖; c-多孔淀粉BET表面積圖

2.1.2 多孔淀粉SEM形態結構分析

為了分析淀粉改性前后表觀形態的差異，使用SEM觀察了淀粉樣品的顯微結構，如圖3所示，成孔反應明顯改變NS原有微觀形貌。不同放大倍數下NS顆粒外形為表面光滑、比較規整且結構致密的球形(圖3-a、圖3-b)，PS顆粒表面粗糙，規整度很差，與NS相比，其表面形成大量分布不均的海綿狀或泡沫狀孔隙結構(圖3-c、圖3-d)，其成因是天然馬鈴薯淀粉糊化后冷藏形成包容著大量水分的水凝膠，在溶劑交換過程中，乙醇流入水凝膠中形成醇凝膠，蒸發時乙醇逃逸形成孔隙和泡沫結構，與水凝膠比較，醇凝膠在直接干燥過程中能避免孔隙的塌陷，有助于保持多孔狀結構[22]。

a-天然馬鈴薯淀粉×5 000; b-天然馬鈴薯淀粉×30 000; c-多孔淀粉×5 000; d-多孔淀粉×30 000

2.2 阿魏酸多孔淀粉酯結構表征

2.2.1 阿魏酸多孔淀粉酯取代度(DS)

淀粉聚合物鏈中每個AGU中C2、C3、C6上3個游離羥基均可作為位點與羧酸發生酯化反應[12]。酯化反應中，吡啶作為堿性親核?；呋瘎?，DMSO的溶脹作用激活暴露的羥基，使PS受到親電試劑的攻擊。淀粉顆粒具備大的比表面積暴露更多化學反應活性位點，對客體分子的敏感性增大[23]，進而提升反應效率獲得更高的取代度。如表1所示，FA-PS的DS隨FA與PS反應摩爾比增加而增大，反應中阿魏酰氯濃度越高，淀粉附近的分子碰撞率越高，分子的利用率就越高。化學改性淀粉的安全性一直是食品及醫藥應用中的首要考慮的問題，李顏利[16]的研究表明，在實驗濃度范圍內，先制備阿魏酰氯再酯化多糖得到的酯化物本身對多種細胞(人體肝癌細胞HepG2、人胰腺上皮細胞EC、成年人皮膚成纖維細胞HSF)無毒性。

表1 阿魏酸多孔淀粉酯的DS

2.2.2 SEM形態結構分析

酯化改性后，淀粉顆粒表面粗糙，呈泡沫狀多孔狀結構。酯化反應在非水相體系中進行，可避免孔結構因水的溶脹作用及糊化作用而崩塌，圖4-a中低DS的FA-PS孔大小不一，分布不均勻，而比較圖4-b、圖4-c，高DS淀粉酯的孔呈蜂窩狀絮狀并趨于均勻致密化分布，結果表明淀粉酯化反應強度與結構有較強的關聯性，可能與酯化反應發生在淀粉表面及淀粉顆粒內部有關，酯化前后SEM結果顯示樣品表面形貌產生差異的原因需要進一步研究。

a-FA-PS-1×5 000; b-FA-PS-2×5 000; c-FA-PS-3×5 000

2.2.3 N2-吸附/脫附分析

相比于PS，圖5-a中FA-PS-3的回滯環變寬而稍緩，毛細冷凝滯后現象較PS更強。FA-PS-3的平均孔徑僅為8.59 nm，較PS平均孔徑縮小了57.52%，屬于介孔材料(圖5-b)，比表面積為83.50 m2/g，相較于PS提升了23.27%(圖5-c)。結果表明酯化反應后形成了更小而均勻致密的孔，此結果與SEM觀察到的結果一致，XU等[24]也觀察到類似的結果，這可能是由于PS發生酯化反應使得淀粉羥基被取代。孔淀粉的負載量隨比表面積的增加而增大，適當減小孔徑可以增強毛細作用力有助于更高的負載[25]。

a-N2-吸附/脫附等溫線; b-孔徑分布圖; c-根據等溫線計算的BET表面積圖

2.2.413C CP/MAS NMR分析

為了確認酯化反應過程中FA與PS之間酯鍵的形成，對PS和FA-PS-3進行13C CP/MAS NMR分析，根據文獻給出了多孔淀粉分子中碳原子的對應信號[26]。如圖6所示，酯化反應后，FA-PS-3的淀粉骨架結構保持良好。隨著酯化反應的進行，淀粉上引入了阿魏?；?，與PS相比，FA-PS-3譜圖中除了淀粉AGU的信號峰外，在109～160范圍內的碳信號來自于阿魏?；?，165處出現羰基信號，這是由酯鍵的13C化學位移引起的，55處出現的峰為阿魏?；霞籽趸男盘柗錥17]，結果表明，通過酯化反應成功形成了FA和PS之間的骨架連接。

圖6 多孔淀粉和阿魏酸多孔淀粉酯的13C CP/MAS NMR譜圖

2.2.5 FT-IR分析

圖7 阿魏酸、天然馬鈴薯淀粉、多孔淀粉及阿魏酸多孔淀粉酯的紅外光譜圖

2.2.6 XRD分析

改性反應對淀粉結晶結構的影響如圖8所示，NS的X射線衍射圖中5.2°、15.2°、17.2°、22.9°處存在較強的衍射峰，表明天然馬鈴薯淀粉屬于B型結晶。而PS的圖譜中僅觀察到對應于無定形物質的分散性寬峰，淀粉高度有序的晶體結構由分子內和分子間的氫鍵負責，PS在制備過程中糊化作用使淀粉微晶熔融，導致有序的晶相轉變為非晶無序狀態，淀粉的穩定氫鍵斷裂和晶體結構的破壞，可導致活性和游離羥基的產生，這有助于增加淀粉的反應性[28]。FA-PS 在13.0°、17.9°、20.4°、25.7°處觀察到新的衍射峰，表明酯化作用形成新的晶體結構，且峰值強度隨著DS的增強而增大。其晶型回生可能由于淀粉顆粒崩解形成的短鏈直鏈淀粉在回生過程中重新聚集并結晶，直鏈淀粉分子可形成雙螺旋進而形成結晶域，具體形成機理有待進一步研究。

圖8 天然馬鈴薯淀粉、多孔淀粉及阿魏酸多孔淀粉酯的X射線衍射圖

2.3 DPPH自由基清除能力分析

為了評估酯化改性后FA-PS的抗氧化活性，測定PS和FA-PS對DPPH自由基的清除率如圖9所示，PS幾乎沒有清除DPPH自由基的能力，而FA-PS對DPPH自由基的清除率隨體系濃度和DS的增加而增強，FA-PS-3對DPPH自由基的清除率最高達到67.76%，WEN等[29]也觀察到類似結果。酯化反應后淀粉聚合物鏈上接入的阿魏?；强棺杂苫钚缘臎Q定因素，由于酚羥基與自由基反應形成共振穩定的苯氧基，丙烯酸側鏈的共軛雙鍵可以通過共振對苯氧基產生穩定作用，供電子體甲氧基有效加強苯氧基穩定性[6]，使FA-PS具備了較強的抗氧化活性。

圖9 多孔淀粉和阿魏酸多孔淀粉酯的DPPH自由基清除能力

2.4 水溶性

淀粉改性后水溶性改善情況如圖10所示，由于化學結構中苯環和短不飽和烴鏈的存在，阿魏酸在水性介質中溶解性很差[6]。天然馬鈴薯淀粉不溶于冷水，靜置后沉淀于試管底部，多孔化改性后的高比表面積大大增加親水性表面，PS的水溶性有所改善，酯化改性后FA-PS的水溶性得到了明顯的提升，且隨淀粉酯取代度增加，水溶性逐漸增強。對于大多數低溶解度和高胃腸道滲透性的活性劑，其體內生物利用度可通過提高溶解度有效提升[9]。該研究結果表明，FA-PS有望應用于食品和醫藥相關領域。

圖10 天然馬鈴薯淀粉、多孔淀粉、阿魏酸及阿魏酸多孔淀粉酯的水溶性

2.5 體外消化性能分析

淀粉基載體攝入后會在口腔和腸道階段被淀粉酶侵蝕，從而限制其通過口服途徑遞送活性物質的位點依賴性釋放能力。為研究多孔化和酯化改性對淀粉體外消化性能的影響，測定NS、PS和FA-PS的體外消化率，結果如圖11所示。與NS相比，PS的快消化淀粉和慢消化淀粉含量分別為21.68%和27.56%，均顯著增高，抗性淀粉含量為50.75%，顯著降低(P<0.05)。 PS中孔隙、孔道和空腔的存在增加了酶反應的表面，消化酶水解的敏感性增強，同時多孔化改性后PS的結晶結構處于不定形狀態，通常分子無序、松散堆積可能容易結合淀粉酶進行水解，淀粉中這種不明確的分子排列順序更容易被酶消化[30]?；诎⑽乎；幕瘜W修飾，隨DS增大，FA-PS的快消化淀粉和慢消化淀粉含量逐漸減少，抗性淀粉含量增加。FA-PS-3的抗性淀粉含量高于NS，顯著高于PS(P<0.05)，達到73.85%。FA-PS的高比表面積同樣提供了更多酶反應位點，但是，研究表明FA可以抑制淀粉消化酶的催化效率[5-6]。同時PS與FA酯化時分子重排影響淀粉消化速率，淀粉酯中聚合物分子有序化排列減少了淀粉消化酶與活性位點的結合，有效阻止了酶對淀粉的水解，導致與PS相比，FA-PS的體外抗消化性能顯著提升。

圖11 天然馬鈴薯淀粉、多孔淀粉及阿魏酸多孔淀粉酯的體外消化率

3 結論