肺癌患者術后血液高凝狀態(tài)與外周血循環(huán)腫瘤細胞的相關性分析

王曉康 袁錦權

廣東省東莞市松山湖中心醫(yī)院胸心外科，廣東東莞 523000

近幾十年來，隨著人們生活方式的改變、環(huán)境污染和吸煙人數(shù)的增加，肺癌患者的發(fā)病率和死亡率逐年增高[1-2]。肺癌患者在患病期間以及手術前后往往伴隨一系列的并發(fā)癥，其中靜脈血栓栓塞在肺癌活動期的發(fā)生風險越來越受到研究者的關注[3-5]。研究表明，血液的高凝狀態(tài)是靜脈血栓形成的直接因素，出現(xiàn)靜脈血栓的患者生存期明顯縮短，同時血液的高凝狀態(tài)促進腫瘤的發(fā)展和轉移[6]。而外周血循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）是腫瘤轉移的必要前提條件，目前有關血液高凝狀態(tài)與外周血CTC 之間的關系研究較少，因此本研究通過對120 例經(jīng)肺癌切除術的患者臨床資料進行回顧性分析，以分析血液高凝狀態(tài)與外周血CTC 之間的關系及其對肺癌患者術后恢復的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取2015年2月至2017年5月松山湖中心醫(yī)院胸外科收治的120 例肺癌患者為研究對象，根據(jù)外周血CTC 的檢測結果分為CTC 陽性組（42 例）和CTC 陰性組（78 例）。納入標準：①經(jīng)醫(yī)院病理學檢驗確診為原發(fā)性肺癌；②接受肺癌根治術治療；③卡氏評分≥60 分[7]；④未接受過其他抗腫瘤治療。排除標準：①不能接受肺癌切除手術治療；②合并患有其他部位腫瘤；③合并患有靜脈栓塞疾病；④合并患有其他肺部疾病的患者；⑤手術前使用過抗凝或止血類藥物；⑥嚴重肝、腎功能不足者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

1.2 方法

于手術后48 h 采集患者空腹狀態(tài)下的靜脈血，分別采用全自動血凝分析儀（貝克曼ACL7000）和血細胞分析儀（貝克曼LH750）對患者外周血中的D-二聚體（D-dimer，D-D）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）因子和血小板（platelet，PLT）水平，同時檢測外周血CTC。實驗操作如下： 取無菌的PBS 緩沖液5 ml 與采集的血液充分混勻，加入等體積的Ficoll 分離液，1500 r/min離心20 min，離心完畢小心吸取中間乳白色的單核細胞層，轉移至新的15 ml 離心管中，加入5 倍體積的PBS 緩沖液與細胞充分混勻，室溫下以轉速2000 r/min離心15 min，離心結束后棄掉上清，然后加入10 ml無菌PBS 緩沖液將細胞重懸，同樣轉速離心10 min。棄掉上清，用100 μl 磁珠緩沖液將細胞重懸，加入15 μl CD45 抗體溶液，輕吹混勻后，于4℃靜置孵育20 min。孵育的過程中取出免疫磁珠，用磁珠緩沖液清洗一遍，然后用2 ml 磁珠緩沖液重懸備用。抗體孵育完畢后，加入10 ml 磁珠緩沖液，室溫下2000 r/min離心5 min，舍棄上清液。用準備好的磁珠緩沖液將細胞重懸，用混勻儀室溫充分混勻15 min。混勻后用移液槍將細胞轉移至美天旎磁珠分選柱，常壓過柱子，待液體流動完畢加入500 μl 緩沖液沖洗2 次，合并收集流穿液。將收集的細胞懸液于2000 r/min 離心10 min，棄上清，輕彈細胞團至散開，然后將其取出均勻的涂抹在載玻片上，采用4%多聚甲醛在室溫下將細胞固定10 min，用PBS 洗滌三次，加入抗廣譜角蛋白抗體于2～8℃孵育30 min，然后用PBS 洗滌一次，加入二抗孵育30 min。最后采用HE 染色5 min，風化脫水至透明狀態(tài)，以中性樹膠封片，方法參考文獻[20]。

1.3 觀察指標及評價標準

外周血D-D 的正常范圍為0～0.55 mg/L，F(xiàn)IB 正常范圍為1.8～3.5 g/L，PLT 正常范圍為（125～350）×109/L。CTC 陽性判斷標準：通過顯微鏡觀察細胞呈圓形或橢圓形，可見完整細胞膜和清晰的細胞形態(tài)，細胞平均直徑大于10 μm；細胞質(zhì)染色陽性，呈藍黑色或褐色；核質(zhì)比異常[19]。

收集并對比所有患者的臨床資料，依據(jù)外周血CTC 的檢測結果將患者分為CTC 陽性組和CTC 陰性組。同時分析所有患者的臨床資料以及D-D、FIB和PLT 等凝血指標進行分析對比。在手術結束后至2020年5月，定期對患者進行電話或門診隨訪，患者死亡則終止隨訪，根據(jù)死亡和存活情況將患者分組，并分析術后預后的危險影響因素。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；單因素分析采用χ2檢驗，單因素分析中，差異有統(tǒng)計學意義的變量，納入多因素logistic 回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者臨床資料的比較

CTC 陽性組術后腫瘤轉移、淋巴結轉移的發(fā)生率及TMN 分期為Ⅲ期的占比高于CTC 陰性組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組患者臨床資料的比較[n（%）]

2.2 兩組患者凝血指標的比較

CTC 陽性組患者的外周血中D-D、FIB 及PLT 水平均高于CTC 陰性組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 兩組患者凝血指標的比較（±s）

表2 兩組患者凝血指標的比較（±s）

組別 D-D（mg/ml） FIB（g/L） PLT（×109/L）CTC 陽性組（n=42）CTC 陰性組（n=78）t 值P 值3.42±0.54 0.75±0.66 16.710＜0.001 4.01±0.98 0.98±1.02 13.452＜0.001 366.75±35.63 231.41±52.13 9.665＜0.001

2.3 肺癌患者術后預后的影響因素分析

從隨訪開始到隨訪結束，所有患者的平均隨訪時間為（31.35±2.95）個月，其中5 例患者脫落，115 例患者中，死亡35 例，3年的存活率為69.57%（80/115）。單因素分析顯示，死亡組患者TMN 分期為Ⅲ期、CTC為陽性的患者比例均高于存活組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表3）。由于性別、年齡、吸煙史、TMN 分期、病理分型、CTC、手術切除方式都可能影響預后，為了明確是否有混雜因素，故均納入多因素分析，結果顯示，TMN 分期及CTC 是患者死亡的獨立影響因素（P＜0.05）（表4）。

表3 影響肺癌患者術后預后的單因素分析[n（%）]

表4 影響肺癌患者術后預后的多因素分析

3 討論

血液高凝是由多種疾病原因引起的血液中促凝血因子增加、抗凝血因子水平下降的一種狀態(tài)，患者往往會出現(xiàn)纖溶功能受損、靜脈瘀血、高脂血癥、低蛋白血癥和血液黏滯度增加等臨床癥狀，而且激素和利尿劑的使用都會引起血漿FIB 水平及其降解產(chǎn)物的增高，從而產(chǎn)生血液高凝狀態(tài)[8-9]。最初這種現(xiàn)象是在腎病綜合征病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，血液高凝的發(fā)生和發(fā)展貫穿在許多慢性疾病中比如心腦血管疾病、 糖尿病、高血脂和血栓性疾病中，后來的臨床觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤患者術后同樣容易發(fā)生血液的高凝狀態(tài)，而且這種狀態(tài)會對腫瘤患者術后的預后產(chǎn)生極大的影響[10-12]。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，90%以上發(fā)生腫瘤惡性轉移的患者體內(nèi)都存在血液高凝狀態(tài)，包括急性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌、肺癌、胰腺癌等[13]。其中肺癌是最常見的惡性腫瘤，也是最容易轉移的腫瘤，其致死率在所有癌癥中居首位[14]。腫瘤利用多重手段打破了機體的凝血和抗凝系統(tǒng)的平衡，手術切除、放療和化療等一些治療手段會加重這種失衡的狀態(tài)，從而使機體血液處于高凝狀態(tài)，而這種高凝狀態(tài)對于腫瘤的惡化具有促進作用，并且能夠促進腫瘤的發(fā)展和轉移[15]。因此，臨床醫(yī)生越來越關注腫瘤患者血液高凝狀態(tài)的機制研究，并在發(fā)生早期采取一定的干預手段，這對于腫瘤患者的治療、術后良好的預后和生存期的提高具有積極的指導意義[16]。

血液高凝狀態(tài)是靜脈血栓發(fā)生發(fā)展的初期階段，在這個過程中，D-D、FIB 和PLT 等因子發(fā)揮著重要的作用，臨床上常作為血栓形成和高凝狀態(tài)診斷的指標[17]。D-D 是血液中FIB 經(jīng)過纖溶酶活化和分解后的降解產(chǎn)物，其水平升高說明機體的FIB 溶解過度并存在高凝狀態(tài)，因此血液中D-D 的水平對于血栓性疾病的診斷和療效評估具有一定的指導意義[18]。FIB 是血液中含量最豐富的凝血因子，其在凝血過程中在凝血酶作用下降解為單體蛋白質(zhì)而發(fā)揮凝血功能，其在感染過程和腫瘤患者體內(nèi)水平明顯升高，是血栓發(fā)生的危險因素[19]；PLT 是參與凝血的重要組分之一，在腫瘤患者體內(nèi)，PLT 被腫瘤細胞分泌的凝血活性因子黏附聚集在腫瘤表面，同促進腫瘤細胞的快速轉移和發(fā)展[20-21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，CTC 陽性組患者在術后發(fā)生腫瘤轉移和淋巴結轉移的比例高于CTC 陰性組患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），同時CTC 陽性組患者中TMN分期為Ⅲ期的比例高于CTC 陰性組患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示CTC 的存在促進了腫瘤細胞的轉移和惡性發(fā)展。對患者外周血檢測發(fā)現(xiàn)，CTC 陽性組患者的外周血中D-D、FIB 和PLT 的水平均高于CTC 陰性組的患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明外周血中CTC 的存在與腫瘤患者的血液高凝狀態(tài)具有一定相關性。CTC 的存在是腫瘤發(fā)生轉移的早期現(xiàn)象，同時腫瘤細胞通過分泌一些促凝因子激活外周血中的凝血酶原，促進凝血，從而提高了腫瘤細胞在組織靶器官的黏附，促進其轉移灶的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，CTC 陽性的肺癌患者在根治術后容易發(fā)生血液高凝狀態(tài)，并伴隨著腫瘤的術后轉移，可對肺癌患者的臨床診斷和病情評估提供參考依據(jù)，對患者的術后預后具有一定的預測價值。