血清IL-33水平及其基因多態(tài)性與HBV感染臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性

劉婷婷， 林玉婷， 米 拉， 李曉勤

（烏魯木齊市婦幼保健院檢驗(yàn)科，新疆 烏魯木齊 830001）

目前，全球范圍內(nèi)約有3億人感染或攜帶乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），亞洲和非洲為高發(fā)地區(qū)[1]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國約有2 300萬例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者，而HBV感染人數(shù)則高達(dá)1.3億[2]。機(jī)體感染HBV后會產(chǎn)生抗病毒免疫應(yīng)答，一方面可控制病毒的復(fù)制，清除病毒，促使部分患者病情得到緩解甚至康復(fù)；另一方面，抗病毒免疫應(yīng)答會誘使機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)，導(dǎo)致部分患者肝臟受到損傷，甚至進(jìn)展為肝硬化或肝癌[3]。有研究結(jié)果顯示，有10%～30%的HBV感染者會發(fā)展為肝硬化或肝癌[4]。因此，分析肝硬化的發(fā)病機(jī)制，探討特異性生物學(xué)指標(biāo)具有十分重要的臨床意義。白細(xì)胞介素33（interleukin 33，IL-33）是白細(xì)胞介素家族成員之一，主要通過參與輔助性T細(xì)胞（T helper cell，Th）介導(dǎo)的免疫應(yīng)答及促進(jìn)炎性反應(yīng)來調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡[5]。HBV的清除及感染的慢性化與Th1/Th2平衡密切相關(guān)[6]。為此，本研究擬探討血清IL-33水平及其基因多態(tài)性與HBV感染臨床轉(zhuǎn)歸之間的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

在2017年1月—2020年1月烏魯木齊市婦幼保健院婚檢或因不孕不育而就診的患者中選取341例HBV感染患者，其中自限性HBV感染者93例（自限性感染組，其中男60例、女33例，年齡35～47歲）、無癥狀慢性HBV攜帶者91例（HBV攜帶組，其中男56例、女35例，年齡36～47歲）、CHB患者90例（CHB組，其中男55例、女35例，年齡34～46歲）、乙型肝炎相關(guān)肝硬化患者67例（肝硬化組，其中男40例、女27例，年齡35～47歲）。各組間年齡和性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。女性患者在烏魯木齊市婦幼保健院完成隨訪；男性患者轉(zhuǎn)院至綜合性醫(yī)院（合作單位）進(jìn)行治療并完成隨訪。本研究經(jīng)烏魯木齊市婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號：（2016）022]。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）HBV攜帶者為血清乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性，且1年內(nèi)隨訪3次，每次間隔3～4個月，每次隨訪丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）水平均正常；（2）自限性HBV感染者為無急性或慢性乙型肝炎史，且未接種過乙型肝炎疫苗，HBsAg和乙型肝炎e抗原陰性，血清乙型肝炎表面抗體和/或乙型肝炎核心抗體或乙型肝炎e抗體陽性，ALT水平正常；（3）肝硬化及CHB診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015更新版）》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；（4）年齡≥18周歲；（5）研究對象及其家屬知情同意。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）既往有手術(shù)史者；（2）合并其他肝炎病毒感染或肝臟疾病者；（3）合并嚴(yán)重其他疾病者；（4）精神狀態(tài)異常或依從性差者。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 采集所有對象入組次日清晨空腹靜脈血12 mL，平均分成4份，其中2份置于枸櫞酸鈉抗凝管中，用于ALT、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TB）檢測及外周血DNA提取；2份置于無添加劑真空管中，立即分離血清，用于IL-33及HBV DNA檢測。

1.3.2 生化指標(biāo)檢測 ALT、AST及TB檢測試劑盒購自美國R&D公司，檢測儀器為AU5800全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）。嚴(yán)格按儀器和試劑盒說明書操作。

1.3.3IL-33基因rs10975519位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性檢測 采用DNA提取試劑盒[伊艾博（武漢）科技股份有限公司]提取外周血DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR） 檢測IL-33基因rs10975519位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性。檢測儀器為ABI 7500型熒光定量PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司）。引物由北京鼎國生物科技有限公司設(shè)計并合成，上游引物序列為5'-ACCTTTATGCCACTGCTATGA-3'，下游引物序列為5'-GAATCTAAGGTTTTACCATGAGC-3'。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，變性95 ℃ 10 min，退火60 ℃ 1 min，循環(huán)35次。嚴(yán)格按儀器和試劑盒說明書操作。

1.3.4 血清IL-33水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清IL-33水平，試劑盒購自上海碧云天公司，檢測儀器為Microlab STAR多功能酶標(biāo)儀（瑞士Hamilton公司）。嚴(yán)格按儀器和試劑盒說明書操作。

1.3.5 血清HBV DNA檢測 采用PCR檢測血清HBV DNA載量。試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，檢測儀器為DA7600實(shí)時熒光定量PCR儀（杭州安譽(yù)科技有限公司）。嚴(yán)格按儀器和試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)對計量資料進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析；兩兩比較時，若方差齊性，采用LSD-t檢驗(yàn)，若方差不齊則采用Dunnett-t3檢驗(yàn)。計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析評估IL-33與ALT、AST及TB的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組各項(xiàng)指標(biāo)的比較

自限性感染組、HBV攜帶組、CHB組、肝硬化組ALT、AST、TB及IL-33水平依次升高，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組各項(xiàng)指標(biāo)的比較 ±s

表1 各組各項(xiàng)指標(biāo)的比較 ±s

注：與自限性感染組比較，*P<0.05；與HBV攜帶組比較，#P<0.05；與CHB組比較，△P<0.05；空白表示無此項(xiàng)。

組別 例數(shù) ALT/（U/L） AST/（U/L） TB/（μmol/L） IL-33/（pg/mL）自限性感染組 93 31.34±5.92 33.29±6.03 59.47±9.95 39.21±7.35 HBV攜帶組 91 36.26±3.35* 50.22±10.94* 89.58±13.34* 84.56±17.83*CHB組 90 125.57±34.13*# 131.48±30.93*# 123.89±15.92*# 128.74±34.72*#肝硬化組 67 355.31±102.58*#△ 294.87±86.34*#△ 189.72±23.21*#△ 198.71±45.66*#△F值 711.151 606.994 435.298 969.724 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

2.2 IL-33水平與ALT、AST及TB水平的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，IL-33水平與ALT、AST及TB水平均呈正相關(guān)（r值分別為0.447、0.459、0.512，P值分別為<0.001、<0.001、0.018）。

2.3 CHB組及肝硬化組不同亞組血清IL-33水平比較

根據(jù)HBV DNA、ALT、AST及TB參考區(qū)間上限分別將CHB組及肝硬化組進(jìn)行分組，并比較血清IL-33水平。在CHB組中，HBV DNA>1×105者血清IL-33水平高于HBV DNA≤1×105者（P<0.05），ALT>40 U/L者與ALT≤40 U/L者之間、AST>40 U/L者與AST≤40 U/L者之間、TB>20 μmol/L者與TB≤20 μmol/L者之間血清IL-33水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。在肝硬化組中，HBV DNA>1×105者、ALT>40 U/L者、AST>40 U/L者及TB>20 μmol/L者血清IL-33水平分別高于HBV DNA≤1×105者、ALT≤40 U/L者、AST≤40 U/L者及TB≤20 μmol/L組（P<0.05），見表3。

表2 CHB組不同亞組之間血清IL-33水平比較pg/mL，±s

表2 CHB組不同亞組之間血清IL-33水平比較pg/mL，±s

注：與HBV DNA≤1×105 拷貝/mL比較，*P<0.05；空白表示無此項(xiàng)。

項(xiàng)目 例數(shù) IL-33 HBV DNA≤1×105 拷貝/mL 33 122.94±16.21>1×105 拷貝/mL 57 124.76±12.35*ALT≤40 U/L 39 122.46±15.03>40 U/L 51 123.87±16.12 AST≤40 U/L 34 121.71±15.67>40 U/L 56 124.25±13.78 TB≤20 μmol/L 31 121.54±15.22>20 μmol/L 59 124.21±13.45

表3 肝硬化組不同亞組之間血清IL-33水平比較pg/mL，±s

表3 肝硬化組不同亞組之間血清IL-33水平比較pg/mL，±s

注：與HBV DNA≤1×105 拷貝/mL比較，*P<0.05；與ALT≤40 U/L比較，#P<0.05；與AST≤40 U/L比較，△P<0.05；與TB≤20 μmol/L比較，▲P<0.05；空白表示無此項(xiàng)。

項(xiàng)目 例數(shù) IL-33（pg/mL）HBV DNA≤1×105 拷貝/mL 34 156.78±18.97>1×105 拷貝/mL 33 223.65±24.45*ALT≤40 U/L 31 167.21±14.56>40 U/L 36 209.13±25.56#AST≤40 U/L 29 161.39±22.45>40 U/L 38 211.35±23.11△TB≤20 μmol/L 29 172.34±23.35>20 μmol/L 38 202.94±24.47▲

2.4 各組IL-33基因rs10975519位點(diǎn)基因型及等位基因分布情況

自限性感染組、HBV攜帶組、CHB組及肝硬化組之間IL-33基因rs10975519位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。TT基因型在自限性感染組中分布頻率最高，肝硬化組最低；而TC和CC基因型在自限性感染組中分布頻率最低，肝硬化組最高。見表4。

表4 各組IL-33基因rs10975519位點(diǎn)基因型及等位基因分布情況

3 討論

目前，HBV感染已呈全球流行趨勢。由于HBV可在患者體內(nèi)長期復(fù)制，導(dǎo)致機(jī)體處于“循環(huán)壞死和再生修復(fù)”的惡性循環(huán)中，促使肝細(xì)胞纖維化，若患者未得到及時治療，肝細(xì)胞纖維化過程將進(jìn)一步發(fā)展，并重復(fù)壞死和修復(fù)過程，最終導(dǎo)致患者發(fā)展為失代償期肝硬化甚至原發(fā)性肝癌，而這一過程往往是不可逆的[8]。因此，如何有效預(yù)防和阻止HBV感染患者發(fā)展為肝硬化是臨床關(guān)注的重點(diǎn)。

HBV感染的慢性化與疾病的進(jìn)展密切相關(guān)。根據(jù)細(xì)胞因子的功能可將Th分為Th0、Th1和Th2。當(dāng)感染HBV后，機(jī)體將促進(jìn)免疫機(jī)制活性清除病毒，在此過程中，Th1及Th2起關(guān)鍵作用，且發(fā)揮著不同的作用[9]。在機(jī)體清除肝細(xì)胞中的HBV同時也會導(dǎo)致肝功能出現(xiàn)不同程度的損傷，當(dāng)HBV未被完全清除時，會進(jìn)一步發(fā)展為慢性HBV感染，這一過程與Th2介導(dǎo)的體液免疫密切相關(guān)[10-11]。

目前，病理活檢是肝臟疾病診斷和分期的金標(biāo)準(zhǔn)。但病理活檢存在一定的不足：（1）取樣部位局限，導(dǎo)致檢查結(jié)果可能存在一定的偏差；（2）屬于有創(chuàng)檢查，患者接受度較低；（3）難以長期監(jiān)測病情，無法提供動態(tài)結(jié)果。因此，尋找可用于乙型肝炎病情監(jiān)測的特異性生物學(xué)指標(biāo)具有十分重要的臨床意義。IL-33參與了機(jī)體炎性反應(yīng)過程及免疫機(jī)制，與多種免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。有研究結(jié)果顯示，IL-33可同時放大Th1及Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，從而對機(jī)體的免疫應(yīng)答起到調(diào)節(jié)作用[12]。VOCCA等[13]的研究結(jié)果顯示，慢性乙型肝炎患者IL-33水平顯著上升，并在HBV感染的慢性化進(jìn)程中起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，隨著HBV感染患者病情的加重，血清IL-33水平逐漸升高，說明IL-33可能與HBV感染的嚴(yán)重程度有關(guān)。本研究進(jìn)一步將CHB組和肝硬化組根據(jù)HBV DNA載量及ALT、AST、TB水平進(jìn)行分組。結(jié)果顯示，在CHB組中，HBV DNA載量較高者血清IL-33水平顯著升高；在肝硬化組中，HBV DNA載量及ALT、AST、TB水平較高者血清IL-33水平顯著升高。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，IL-33水平與ALT、AST及TB水平均呈正相關(guān)（r值分別為0.447、0.459、0.512，P值分別為<0.001、<0.001、0.018）。這也進(jìn)一步證實(shí)IL-33在HBV感染的慢性化進(jìn)程中發(fā)揮著一定的作用。

IL-33基因rs10975519位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性分析結(jié)果顯示，各組IL-33 rs10975519位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。TT基因型在自限性感染組中分布頻率最高，肝硬化組最低；而TC和CC基因型在自限性感染組中分布頻率最低，肝硬化組最高。這提示IL-33基因rs10975519位點(diǎn)與慢性HBV感染有關(guān)，且C等位基因可能會增加CHB進(jìn)展為肝硬化的風(fēng)險。

本研究尚有不足之處：（1）本研究為單中心研究，樣本量較小且來源單一；（2）IL-33基因rs10975519位點(diǎn)的表達(dá)在不同地區(qū)及種族之間存在一定的差異，但本研究受樣本量限制，未進(jìn)一步對不同地區(qū)或種族進(jìn)行分析；（3）未分析原發(fā)性肝癌患者的血清IL-33水平及IL-33基因rs10975519位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性。

綜上所述，IL-33水平與HBV感染的病情進(jìn)展密切相關(guān)，IL-33基因rs10975519位點(diǎn)C等位基因可能會增加CHB進(jìn)展為肝硬化的風(fēng)險。