食品中嘔吐毒素Cereulide特性及 檢測方法研究進展

羅信旭，謝 珊

（貴州省疾病預防控制中心，貴州貴陽 550004）

1 Cereulide特性

Cereulide是由蠟樣芽孢桿菌ces基因簇編碼的產物，該基因簇位于蠟樣芽孢桿菌質粒DNA上，主要包括7個編碼區，其中cesA基因和cesB基因與Cereulide合成有關。Cereulide具有致吐作用，故稱其為嘔吐毒素。值得注意的是該嘔吐毒素與人們常說的嘔吐毒素（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，DON）是兩種不同的物質，后者由鐮刀菌產生。除蠟樣芽孢桿菌能產生Cereulide外，耐冷型魏登施泰藤芽孢桿菌（Bacillus weihenstepha nensis）也能產生Cereulide。Cereulide是由[D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val]3組成的一種十二環狀多肽，分子量1.2 kDa，不溶于水，脂溶性大，耐蛋白酶水解，對酸、堿不敏感，在121 ℃高溫下維持30 min仍具有活性，一般的食品加工過程不能將其破壞，屬于耐熱型腸毒素，在活菌被消除的情況下仍存在食物中毒的風險。Cereulide是一種特異性K+載體，能將K+轉入線粒體內，從而改變細胞內外K+濃度差，進而破壞線粒體的氧化還原能力，影響細胞的正常代謝。Cereulide的同分異構體有7種，分別為Isocereulide A～G[1]。其化學結構、相對分子量與纈氨霉素十分相似，但Cereulide與K+的親和力更大，毒性更強。Cereulide會使腸道細胞上皮電阻變大，緊密連接蛋白claudin-4的表達量增加，從而改變腸道細胞的生物轉化，使腸道喪失屏障功能[2]。

2 Cereulide影響因素

2.1 菌株類型

Cereulide的產量是由內在因素（菌株類型）和外在因素（環境因素）共同決定的。并非所有蠟樣芽孢桿菌都能產生Cereulide，如ATCC 14579，該菌株不產生嘔吐毒素，過去研究得出只有5%～6%的蠟樣芽孢桿菌能產生[3]。最近大多數研究發現，蠟樣芽孢桿菌攜帶Cereulide基因的范圍已遠高于5%～6%[4-5]。

2.2 環境因素

環境因素對Cereulide合成的影響很大，主要包括溫度、環境pH、氧氣、離子濃度和基質類型的影響。研究發現，產生Cereulide的蠟樣芽孢桿菌的培養溫度主要集中在12～45 ℃，低于12 ℃部分基質中仍能產生Cereulide，超過45 ℃不再產生。AGATA研究發現[6]，酸性條件下蠟樣芽孢桿菌更容易產生Cereulide。楊佐毅等人[7]發現Cereulide的產生必須有氧氣的參與，厭氧條件下不產毒。SHAHEEND等人[8]在研究嬰幼兒配方奶粉中Cereulide產生情況時，發現當氧氣濃度低于1.6%后，蠟樣芽孢桿菌不再產生Cereulide。APETROAIE-CONSTANTIN等人[9]在研究離子濃度對Cereulide合成的影響時，發現低鹽離子濃度更有利于Cereulide的產生。MESSELHAUSSER等人[10]發現富含維生素和微量元素的食物能促進Cereulide的產生。此外，培養基的狀態也會影響Cereulide的產量[11]，固體培養基較液體培養基更容易產生。有學者就不同食物基質對蠟樣芽孢桿菌的生長和Cereulide的產量影響進行研究，發現蠟樣芽孢桿菌在谷物基質中產生的Cereulide明顯高于培養基，在肉和蔬菜基質中產量最少[12]。以上學者對Cereulide合成影響的研究，對食品儲存具有實際的指導意義，應盡量選擇低溫、真空條件保存食品。

3 Cereulide檢測方法

關于嘔吐毒素Cereulide的檢測，主要有以下4種方法。

（1）動物試驗法。該方法只能對Cereulide定性，得出的結果不準確，而且費用較高。

（2）生物檢測法。屬于半定量檢測，目前有兩種，分別是細胞空泡應答檢驗法和體外精子活力試驗法。該方法對實驗室的要求較高，一般實驗室很難進行，不能大面積推廣。

（3）PCR檢測法。該方法能從基因層面上對產Cereulide的菌株進行快速檢測，缺點在于該方法不能達到毒素定量檢測目的。

（4）化學檢測法。有高效液相色譜（HPLC）、飛行時間質譜（HPLC-ESI-TOF）[13]、高效液相色譜串聯質譜（HPLC-MS）[14]、反向色譜（RPC）[15]等，其中HPLC-MS聯用法被認為是Cereulide檢測和定量的金標準，同時也使用得最多。該方法靈敏、準確，定量限為10 ng/kg，檢出限為3 ng/kg。HPLC-MS聯用法測定食品中Cereulide有外標法和內標法兩種。除Cereulide外，人工合成的13C6-Cereulide和纈氨霉素均可作為內標物。研究發現選用13C6-Cereulide作為內標物，結果明顯優于纈氨霉素。HPLC-MS聯用法雖是Cereulide定量的金標準，但該方法所用設備均屬于大型精密高端設備，眾多實驗室不具備該條件，因此，普及十分困難。為了克服以上難題，Kalbhenn等[15]研究者初次嘗試運用RPC對Cereulide進行分離和定量，并運用HPLC-MS聯用法對定量結果進行了驗證，發現RPC能精確地對樣品中的Cereulide進行分離定量。相對HPLC-MS聯用法，RPC是一種更加經濟、更加簡便且常規實驗室均可開展的檢測手段。

4 結語

我國食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測主要采用國家標準GB/T 4789.14—2014和進出口商品檢驗行業標準SN 0176—2003。該方法操作程序復雜，實驗周期長，對致病菌的檢測特異性不高且檢出限較高，主要用于活菌數的定量，不適用于由Cereulide引起的食物中毒，無法有效保證食品安全。近年來，Cereulide引起的食物中毒時有發生，因此建立食品中Cereulide的快速檢測方法和相應的標準十分有必要。