眼部抑制性免疫微環境與調節T細胞楊璐菲

陳養浩 龔學春 武志峰

眼睛和免疫系統通過調節先天性及適應性免疫反應來維持眼部免疫特權，在發生眼內炎癥時，眼部免疫特權能以最大程度降低視力損害的風險[1]。免疫特權最初在20世紀40年代被定義，Peter Medawar等發現植入前房內的同種異體皮膚移植片可以無限期存活，而在其他組織中則會被快速排斥[2]。一方面由角膜以及緊密連接的視網膜色素上皮細胞和視網膜毛細血管內皮細胞構成血-眼屏障，以形成封閉的眼內環境抑制炎癥激活和控制免疫細胞功能[2]。另一方面，眼部觀察不到直接的淋巴管引流，即同種抗原不能到達局部淋巴結并引發免疫反應，但并不代表眼內微環境中沒有免疫細胞及免疫反應。一些眼內駐留細胞可以通過產生可溶性或膜結合分子來誘導調節T細胞(T-regulatory cells，Tregs)，促進免疫抑制性眼內微環境的發展和維持[3]。本文就眼內微環境中的免疫調節劑及調節T細胞在眼部免疫特權中的作用進行綜述，以更好了解眼內免疫特權維護機制，為眼部炎癥相關疾病的診療提供思路。

一、ACAID及調節T細胞

接種到前房的抗原被抗原呈遞細胞捕獲后通過血液攜帶至脾臟，還能運輸至區域淋巴結或胸腺，帶有眼源抗原的抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells, APC)在這些淋巴器官中誘導Tregs，從而抑制T細胞活化和分化為Th1效應細胞，并抑制Th1介導的免疫反應[4,5]。這種前房引入抗原后誘導外周抗原特異性免疫調節機制稱為前房相關免疫偏差(anterior chamber-associated immune deviation, ACAID)，而相關研究顯示玻璃體腔或后房也具有誘導全身免疫偏差的能力，稱為玻璃體腔相關性全身免疫偏差(vitreous cavity-associated immune deviation, VCAID)[5]。目前已鑒定出3種類型的Tregs：CD4+CD25+Foxp3+ Tregs，產生IL-10的Tr1細胞和產生TGF-β的CD4+ Th3細胞，Tr1細胞在激活后只能暫時上調Foxp3，而產生TGF-β的CD4+ Th3細胞缺乏Foxp3表達[6]。其中，CD4+CD25+Foxp3+ T細胞在維持免疫自耐受和體內穩態中起著重要作用。角膜內皮(corneal endothelial, CE)細胞和色素上皮(pigment epithelial, PE)細胞等眼部駐留細胞以及眼內調節因子可以通過誘導Tregs產生促進免疫抑制性眼內微環境的發展和維持，并在免疫相關眼內疾病的發生發展中起重要作用。

二、眼內免疫負調節因子

眼內微環境中存在多種炎癥調節因子，以抑制炎癥激活，維護眼部免疫特權。目前已知這些負調節因子的來源是虹膜、睫狀體細胞以及視網膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)細胞，最重要的免疫抑制因子包括免疫抑制細胞因子(transforming growth factor, TGF)- β2，免疫調節神經肽α-黑素細胞刺激激素(melanocyte-stimulating hormone, MSH)，以及膜表達的 程序性死亡受體-1(programmed death-ligand 1, PD-L1)和Fas配體(Fasligand, FasL)。

1.TGF-β2房水中含有許多免疫抑制分子，其中轉化生長因子-β2(TGF-β2)為主要的抗炎分子，在Tregs的誘導和維持免疫特權的過程中起著重要作用，TGF-β2在房水中的濃度為1-10ng/ml，90%為與潛伏期相關肽結合的潛伏形式[7]。研究顯示暴露于TGF-β2的APC依賴血小板反應蛋白1(Thrombospondin-1, TSP-1)的表達增加來激活潛在的TGF-β2，同時TSP-1結合APC上的受體CD36引起潛在的TGF-β2自分泌，繼而在體內外誘導Foxp3+ Treg細胞的生成[8]。最近研究顯示TGF-β2處理后的RPE細胞可增強CD4+ T細胞向CD4+/CD25+ Tregs細胞的分化，且與天然Tregs細胞相比，RPE細胞誘導的Tregs細胞在抑制CD4+/CD25- T細胞的增殖方面更有效[9]。

TGF- β2還可以抑制巨噬細胞的促炎功能，如炎性細胞因子的分泌或活性氧的產生，TGF-β2還可抑制APC產生IL-12，即偏離Th1反應，并減少CD40激活輔助信號[7]。同時研究表明，TGF-β2能抑制樹突狀細胞(dendritic cell, DC)的成熟，而阻斷TGF-β2可以完全逆轉房水對脂多糖誘導的DC成熟抑制作用[7,10]。

2.α-黑素細胞刺激激素 作為一種典型的免疫調節神經肽，由13種氨基酸組成的α-MSH具有抗炎和免疫調節能力。有研究顯示，患有自身免疫性疾病的眼或受損的視網膜中α-MSH表達缺失，而用α-MSH治療患有眼部葡萄膜炎等小鼠，可以抑制小鼠眼內炎癥[11]。這種神經肽促進效應T細胞分化為Treg細胞，并產生TGF- β，同時α-MSH還能抑制活化的巨噬細胞和小膠質細胞介導的眼內炎癥[3,12]。對先天免疫細胞的促炎信號的抑制通常是通過在巨噬細胞上表達的MC1R和MC3R介導的[13,14], 而對免疫調節的激活則是通過MC5R[15]。除了α-MSH， RPE細胞還組成性表達神經肽Y(neuropeptide Y, NPY)，產生這兩種神經肽是RPE細胞調節巨噬細胞和小膠質細胞活性所必需的。NPY雖然會增強單核細胞的粘附和趨化，以及IL-1 β的產生，但NPY可以誘導產生抗炎TGF-β，且NPY對吞噬作用的影響也是矛盾的[12,16]。與α-MSH和NPY共處理的巨噬細胞表達髓樣抑制細胞的特征[17]，且這種被處理過的巨噬細胞在吞噬酶體的激活和FcR介導的活性氧生成方面收到了抑制[16]。近來研究顯示，此類巨噬細胞在吞噬體的成熟方面也受到了抑制，更重要的是在自身抗原加工成肽的過程中也受到了影響[12]。

3.FasL Fas是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)的成員，是一組I型跨膜蛋白，而FasL為Fas配體，亦屬于TNF家族，為一組Ⅱ型膜蛋白。Fas-FasL相互作用是維持眼內免疫特權的重要機制，病毒感染后，進入前房的炎癥細胞發生依賴于Fas-FasL途徑的凋亡。而在缺乏功能性FasL的小鼠中，病毒感染導致了眼內炎癥及組織損傷[18]。據報道，FasL存在兩種作用相反的表達形式，膜表達型mFasL與Fas結合后具有促炎作用，而mFasL被金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)裂解后產生的可溶性sFasL，與Fas結合后則具有抗炎作用[19,20]。一些研究提示sFasL可作為眼內炎癥的治療位點。單純皰疹病毒1感染小鼠后，用sFasL治療的小鼠角膜通過流式細胞儀及免疫組化顯示相對較少的中性粒細胞。同時，靶向表達sFasL的血管內皮細胞可顯著減少新生血管的形式[20]。這提示sFasL不僅能抑制角膜炎癥浸潤，在新生血管形成方面也有潛在治療益處。另一項研究也顯示用sFasL治療后，患有脈絡膜新生血管的小鼠新生血管侵襲減少[21]。此外sFasL可阻斷mFasL誘導的中性粒細胞外滲[22]，僅表達mFasL的小鼠角膜對角膜清創術產生的無菌性炎癥及LPS刺激下的炎癥更敏感，而sFasL阻斷了中性粒細胞流入角膜，并且對LPS誘導的角膜炎更有效[23]。眼部腫瘤誘發的炎癥程度和腫瘤轉移潛力也受兩種FasL表達水平的影響，高表達mFasL的眼內腫瘤易誘發眼內炎癥，高表達sFasL則能在眼內緩慢生長，但mFasL表達的降低和sFasL表達的升高有助于腫瘤的肝轉移[19]。

4.PD-L1 PD-1及其配體PD-L1和PD-L2是共刺激分子B7家族的成員，PD-L1和PD-L2具有重疊的功能，可以協同作用來抑制T細胞活化、增殖和細胞因子的產生，PD-L1在體內起主要作用[24]。當RPE細胞暴露于炎癥環境中時，表達的PD-L1水平升高，這可能是RPE細胞促進局部抗炎反應并加速炎癥消退的重要途徑[25]。最近研究表明在EAU小鼠模型中，阻斷PD-1/PD-L1通路時，誘導的Treg細胞不能抑制效應T細胞，提示PD-1/PD-L1對Treg細胞的抑制活性[27]。

三、眼部駐留細胞

包括角膜內皮細胞及色素上皮細胞在內的眼實質細胞組成性表達CD95配體，與CD95結合后可觸發炎性細胞的凋亡[28]，同時，能誘導Tregs的產生、抑制T細胞活化來維持免疫特權。CE細胞作為眼前房的內表面，與房水直接接觸，通過TGF-β2來抑制CD8+ T細胞的活化，且促進CD8+ T細胞轉化為Tregs。誘導產生的CD8+ Tregs高表達CD25和Foxp3，并抑制效應T細胞的激活[29]。此外，培養表達TGF-β和組織蛋白酶L抑制劑-2α(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-2 alpha, CTLA-2α)的鼠CE細胞可促進CD4+ Treg的生成，從而能夠抑制效應T細胞[30]。之前研究顯示虹膜色素上皮(iris pigment cell, IPE)細胞、睫狀體PE細胞及RPE細胞通過不同機制抑制T細胞活化。IPE細胞通過B7-2/CTLA-4相互作用促進細胞直接接觸來誘導Foxp3+/CD8+/CD25+ Tregs的產生[31]。IPE誘導產生的CD8 + Treg大量表達PD-L1共刺激分子，并通過接觸依賴性機制抑制了表達PD-1的Th1細胞激活[32]。RPE細胞主要以分泌的可溶性因子來實現抑制作用，睫狀體PE細胞能同時利用細胞接觸及可溶性因子這兩種方式來抑制T細胞[33]。RPE細胞組成性表達PD-L1，并通過PD1/PD-L1相互作用及分泌TGF-β來抑制T細胞增殖和炎癥因子產生[34]。此外，在存在CTLA-2α的情況下，培養的RPE細胞通過TGF-β將CD4+ T細胞轉化為Foxp3+ Tregs[35]。RPE細胞產生的視黃酸可增強TGF-β對CD4+ Tregs的誘導作用，視黃酸是TGF-β依賴性免疫應答的關鍵調節劑，并能夠抑制IL-6驅動的Th17細胞誘導[36]。除了能抑制DC的繁殖，有研究顯示RPE細胞還能誘導骨髓來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)的分化。RPE誘導的MDSCs為CD11+Gr+，具有T細胞抑制活性，且IL-6在誘導過程中至關重要，阻斷IL-6會明顯抑制MDSC的分化[35]。 據報道吲哚胺 2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)是一種將必需氨基酸色氨酸分解為穩定代謝產物犬尿氨酸的酶，在干擾素- γ(interferon- γ, IFN-γ)的刺激下，RPE細胞中的免疫抑制酶IDO高度表達，且TGF-β可誘導DC中IDO表達，TGF-β/ IDO /色氨酸代謝產物軸可能參與了免疫抑制環境的維持[9]。

四、自身免疫相關眼部疾病

1.葡萄膜炎 自身免疫性的葡萄膜炎被認為是一種T細胞介導的疾病，房水和玻璃體細胞分析顯示，T細胞多于B細胞[37]。而已有研究證明，α-MSH和TGF-β2誘導產生的抗原特異性Tregs可抑制EAU，LPS激活的DC誘導的CD4+CD25+Foxp3+ Tregs也能抑制CD4+CD25- 效應T細胞，過繼轉移時，這些Tregs也抑制EAU，即Tregs能有效抑制葡萄膜炎[1]。且研究顯示免疫抑制性Foxp3+ Tregs與炎癥的消退有關，RPE細胞誘導的Foxp3+ Treg能夠抑制EAU小鼠的眼部炎癥，此外，當眼內T細胞與RPE細胞誘導的Tregs在體外共培養時，視網膜抗原特異性細胞因子反應，如IFN-γ和IL-17降低了[38]。與活動性葡萄膜病患者相比，緩解患者中CD4+CD25+Foxp3+ Tregs的頻率，TIGIT+ Tregs和T-β+ Tregs的比率以及Tregs與Th1的比率顯著更高，TIGIT+ Tregs可能是臨床緩解的重要預測指標[39]。在活動性葡萄膜炎期間，前房的髓樣DC表達高水平的主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)，但表達低水平的CD86，即炎癥性的前房水仍能抑制DC的功能，這種抑制作用等于或大于非炎性前房水誘導的抑制作用[40]。

2.角膜移植 角膜移植是目前進行的實體器官移植中最成功的形式，根據以往的經驗所得，若宿主角膜中存在血液和淋巴管則排斥率更高，眼內免疫抑制性微環境以及抑制性共刺激信號分子均參與角膜的免疫抑制。PD-L1在角膜內皮細胞上組成性表達，通過誘導表達PD-1的T細胞凋亡來導致排斥反應的抑制，用抗體阻斷PD-L1或PD-1則可增強角膜移植后的排斥反應[41]。誘導型共刺激分子(inducible costimulatory, ICOS)mRNA也在角膜中表達，在ICOS-/-小鼠中，誘導眼睛產生ACAID的效率較低，且與野生型鼠T細胞相比，ICOS-/-T細胞對角膜內皮細胞的破壞作用增強，ICOS介導的Foxp3 + CD4 + Treg的誘導有助于成功地移植角膜[42]。此外，B7-H3、糖皮質激素誘導的TNF受體家族相關蛋白配體及而半乳糖凝集素-9也保護角膜免受T細胞的破壞，阻斷其中之一都能使同種異體移植更易排斥[6]。

3.干眼 干眼(dry eye disease, DED)是一種引起眼部不適及視覺障礙的常見眼部疾病之一，免疫細胞CD4+ T細胞的活化和浸潤有助于DED眼表炎癥的發展。臨床及實驗性的DED結膜中浸潤性T細胞增加，DED小鼠中的CD4+ T細胞過繼轉移后會導致裸鼠的干眼發展[43]。而Tregs可能提供了一種新的治療方式，注射了DED特異性致病性CD4+ T細胞后，用CD4+CD25+Foxp3+ Tres治療可阻止DED的發展[43]。DED動物模型及患者眼中可觀察到IL-17和IFN-γ升高，而Th17細胞似乎是主動介導DED的主要效應物[44]。體內IL-17阻斷不僅會導致Th17 T細胞的生成減少，更重要的是會導致Tregs功能的恢復，使DED的誘導作用和嚴重程度降低[45]。上文已提及TSP-1可促進TGF-β產生，在誘導Tregs中起重要作用。缺乏TSP-1的小鼠表現出淚腺炎性浸潤、淚腺功能障礙及杯狀細胞密度降低相關的角膜上皮屏障受損[46]，且小鼠結膜中CD4+ T細胞浸潤比野生型小鼠高出近三倍[45]。TSP-1自身也可以抑制T細胞活化，并促進Tregs細胞生成，自身免疫相關的眼表疾病可能與TSP-1缺乏有關[46]。已有越來越多的證據顯示眼部免疫負調節劑和Tregs的活化可以保護自身免受炎癥損害，是保持眼部微環境和良好視力的功臣。而在生理情況下，它們又積極參與維持眼部免疫特權，防止過度眼部炎癥引起的組織損傷。

隨著技術發展，一定會有更多調節免疫環境的因子被發現，成為葡萄膜炎等免疫相關眼部疾病的治療靶點。同時不少研究證明視網膜變性、糖尿病性視網膜病變等視網膜血管疾病也與免疫相關，而Tregs也在控制疾病進展中起重要作用[5]。對眼部免疫特權維持機制的進一步研究，對Tregs功能的了解以及新的免疫調節因子的發現可能為眼部自身免疫性治療干預提供一種新方法。