基于生物合成氣囊的影像造影劑的研究進展

黃 馳 張 月 辛 瑩 劉治軍

具有多種影像學對比顯影能力的多模態影像造影劑已成為當前影像學領域的研究熱點之一。多模態影像造影劑多是在其組成成分中加入聲響應、磁性或光敏物質等以實現多模態響應，結構復雜，制備相對繁瑣。氣囊是一類在浮游生物或古菌體內由基因編碼合成的中空雙錐形、剛性、多孔蛋白質納米結構，長約100～600 nm，寬約45～250 nm，囊壁厚約2 nm，其對水不通透，但允許氣體自由通過，因此氣囊內外幾乎無氣壓差，可在納米級尺寸保持穩定的物理狀態［1］。氣囊的這一特殊性質，使其具有同時作為超聲、MRI、光學相干斷層掃描（OCT）等多種模式造影劑的潛力。氣囊主要由8～14個不同的基因編碼，包括2個主要結構蛋白即氣囊蛋白A（GvpA）和氣囊蛋白C（GvpC），以及幾個次要蛋白和調節蛋白組成。GvpA是氣囊蛋白質外殼的主體，GvpC附著在GvpA外層，影響氣囊整體的完整性和結構強度。不同物種來源的氣囊由于其蛋白組成不同，還具有不同的壓力敏感性，在達到某一特定臨界壓力時會破裂，因此可以利用其這一特征進行氣囊破裂前后的圖像減影，獲得來自某一種氣囊的特異性信號［1-2］。此外還可以通過基因編輯等方式對氣囊的組成蛋白進行修飾和改性，從而獲得具有不同抗壓性、靶向性等特性的氣囊［3-4］。研制基于氣囊的多功能造影劑及聲學報告基因是當前研究的熱點。本文就基于氣囊的影像造影劑的研究進展進行綜述。

一、基于氣囊的超聲造影劑

超聲造影劑通過改變局部組織的聲學特性，如背向散射系數、衰減系數、非線性效應等，從而提高超聲成像的分辨力、對比度和準確性。Shapiro等［2］首次報道從水華魚腥藻（Ana）和嗜鹽古菌（Halo）分離提純的氣囊在超聲輻照下能產生穩定、強烈的背向散射信號，可用于超聲造影；且Halo氣囊能產生強烈的二次諧波和三次諧波信號。二次諧波信號是由造影劑微泡在聲場中的非線性運動產生的，其峰值頻率是基波的2倍。通過寬頻超聲探頭接收發射頻率的2倍頻率實現由二次諧波組成的影像，而組織解剖結構的基波信號基本不被接收，從而凸顯來自微泡造影劑的信號，獲得顯著的造影效果。Yang等［5］研究也證明，氣囊具有足夠的回聲特性，且回聲強度與氣囊濃度呈正相關，可作為超聲造影劑的理想材料；并且Ana氣囊在聲場中也能產生顯著的二次諧波，降低組織背景信號和改善圖像質量；而Shapiro等［2］未檢測到Ana氣囊的諧波信號是因為Ana氣囊需在更高頻率的聲場中才能產生二次諧波信號，而這一頻率超過了該實驗中所用的頻率及探頭的接收頻率。Cherin等［6］通過有限元模擬及體外實驗證實，氣囊在靜水中的臨界破壞壓力低于在超聲脈沖中的臨界破壞壓力，當氣囊處于兩個臨界壓力之間的超聲脈沖壓時，能產生穩定、強烈的二次諧波信號。氣囊產生諧波信號的能力與表面的GvpC含量密切相關，GvpC含量高的氣囊剛性更強，更難產生二次諧波信號。2017年Maresca等［7］采用氣囊進行體外、體內造影發現，臨床常用于超聲微泡的非線性對比模式——反轉脈沖和振幅調制可以實現對氣囊產生的諧波信號進行高效地選擇性成像，避免組織背景的散射信號帶來干擾，提高了氣囊的對比度特異性。2020年Maresca等［8］對小鼠進行經顱神經活動的血流動態超聲成像發現，與目前常用的超聲造影微泡聲諾維（SonoVue）相比，氣囊具有更好的成像穩定性，可以檢測到更大范圍和更低血流速度的信號。王宇等［9］利用骨髓間充質干細胞的內吞特性和氣囊的聲學響應性，構建了具有超聲顯影能力的骨髓間充質干細胞，可在移植治療后利用超聲成像長時間追蹤其在小鼠肌肉組織中的分布情況。Le Floc’h等［10］將99mTc與氣囊表面的氨基相互結合，用以觀察氣囊在小鼠體內的分布情況，發現在注射20 min后，84%的氣囊被肝臟代謝，要實現體內長時間造影顯像，則需要對氣囊進行一定的修飾，以避免被網狀內皮系統（RES）迅速吞噬、清除。Ling等［11］研究發現，氣囊在肝組織中被巨噬細胞攝取并經溶酶體降解后，回聲信號消失，因此通過檢測注射氣囊后血液循環和肝臟中超聲強度的動態變化可定量評估小鼠肝臟中巨噬細胞的吞噬和溶酶體降解功能，并在小鼠體內驗證了該技術對巨噬細胞缺乏癥和非酒精性脂肪肝病的診斷價值。Yan等［12］采用脂肪乳或釓劑GdCl3抑制RES后，延長了氣囊在血液循環中存在的時間；采用聚乙二醇（PEG）對氣囊修飾后，避免了其被RES吞噬、清除，顯著延長了氣囊的造影時間。Wang等［13］采用PEG和透明質酸對氣囊進行表面修飾，成功制備出了能避免被RES吞噬，且對CD44陽性的SCC7人鱗狀細胞癌細胞系具有靶向性的氣囊，在腫瘤部位實現了長達48 h的持續增強造影。

二、基于氣囊的MRI造影劑

MRI具有較高的組織空間分辨率、多參數成像等優點，是目前臨床常用的影像檢查方法之一。MRI造影劑通過改變局部組織的磁化率，改變其縱向弛豫時間（T1）和/或橫向弛豫時間（T2）增強組織對比度，從而提高MRI的診斷敏感性和特異性。Lu等［14］發現，由于氣囊中的空氣與周圍環境中的水具有不同的磁化率，氣囊的存在使得其周圍液體環境中的微磁場發生改變，導致其周圍水中的氫原子共振頻率發生改變，可產生類似于超順磁性氧化鐵的效果，在MRI檢查中能夠明顯縮短T2，顯著降低T2加權MRI信號，產生負性增強顯影效果；聯合超聲脈沖破壞氣囊，通過氣囊被破壞前后的MRI減影圖像可以獲得來源于氣囊的特異性信號，避免傳統T2增強造影時原本呈低信號的組織結構（如血管、組織界面等）對病灶信號的干擾。經氣囊在小鼠大腦紋狀體的MRI造影顯示，聯合超聲脈沖的MRI顯著增強了氣囊的對比度特異性。化學交換飽和轉移（CEST）-MRI是新興的基于飽和質子與周圍介質中質子交換的體內分子成像技術，結合分子成像和高質量解剖成像，在多種代謝物成像方面具有獨特優勢［15］。利用氣囊的氣體自由滲透特性，氣囊能夠與氙氣進行化學交換飽和轉移作用，當應用預載超極化氙氣的氣囊作造影劑時，其敏感性大大高于基于氫原子的CESTMRI，可在皮摩爾濃度產生明顯的CEST對比度，而基于氫原子的CEST-MRI需在微摩爾濃度時才能達到類似的CEST對比度［16］。Kunth等［17］發現，氣囊裝載的超極化氙氣在體內分布遵循理想氣體定律，因而基于超極化氙氣的CEST-MRI成像的信號強度與環境中的總氙氣的量呈線性關系，這一特性可以產生基于氙氣濃度的定量CEST-MRI成像的信號。

三、基于氣囊的OCT造影劑

OCT是利用細胞或組織對光的折射率不同產生不同的光學信號來進行成像的一種新型成像方式，具有較高的時空分辨率，可以直觀地顯示生物組織的結構特征化學成分等優點。Lu等［18］發現氣囊特殊的內部中空結構使其具有與周圍組織不同的光折射率，導致氣囊對入射光產生強烈的散射，從而產生可用于OCT成像的光學信號。通過體外造影實驗和對小鼠玻璃體及視網膜下腔的體內造影實驗證實，利用超聲脈沖破壞氣囊后的減影圖像減少了來自內源性背景散射的干擾，提高了OCT的對比度特異性。

四、基于氣囊的聲學報告基因的研究

報告基因的產物是一類可用特定成像方式檢測信號的蛋白質，其信號強度與表達量呈正相關，將報告基因與目的基因融合或在其同源啟動子下實現共表達，可以實現檢測目的基因的表達水平、研究動態分子信、對細胞進行跟蹤監測等目的［19］。Bourdeau等［20］將Ana的GvpA基因和GvpC基因與巨大芽孢桿菌的GvpR-GvpU基因重組，合成了一種新的聲學報告基因（ARG1），在大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌中轉導ARG1后，成功表達出可用于超聲顯影的氣囊。將ARG1導入用于治療腸道疾病的益生菌中后，成功用超聲成像監測到其在小鼠腸道內的分布情況。相對于傳統的熒光報告基因的光學成像，超聲成像能提供更高的空間分辨率，且具有更好的穿透性，可探測到深部組織的信號［21］。Farhadi等［22］利用巨大芽孢桿菌的氣囊基因簇，構建了一組哺乳動物聲學報告基因，轉染到人胚胎腎臟細胞293T中后，成功表達出可被超聲檢測的氣囊，并驗證了其在活體內利用超聲成像相關細胞分布和生物學行為的能力。Lakshmanan等［23］構建了包含不同酶作用位點的GvpC，利用酶切后氣囊產生非線性信號的能力不同，對酶活性進行可視化評估，并成功在體外、益生菌內和小鼠胃腸道內進行成像，顯示出良好的酶活性檢測能力和成像能力。

五、基于氣囊的超聲造影劑在腫瘤治療中的應用

超聲靶向微泡破壞技術是指在超聲實時監測下，在特定部位利用微泡在不同強度的超聲輻照下產生的空化與聲孔效應對細胞膜的一系列影響，達到促進藥物或基因靶向運輸或治療的效果。Szablowski等［24］發現，氣囊在低頻超聲輻照下可以產生空化效應，聯合低頻超聲輻照和對高表達αVβ?整合素受體的人膠質母細胞瘤細胞系U87靶向的RGD-氣囊，其產生的空化效應可對腫瘤細胞造成殺傷作用。另外可將編碼氣囊的基因插入表達治療性藥物的細菌中實現共表達，在實時超聲監測下于特定靶器官中利用氣囊在超聲輻照下產生的空化效應將細菌裂解，在靶器官中釋放出荷載的共表達藥物，從而實現靶向給藥。Tayier等［25］采用聚乙烯亞胺對氣囊進行表面修飾，構建了表面帶正電荷的氣囊，將其作為基因載體。借助氣囊納米級尺寸的優勢，可通過血管內皮間隙，直接進入靶組織細胞外液與靶細胞直接接觸，在超聲顯像的實時監測下聯合低功率聚焦超聲產生的空化效應，可以提高靶組織的轉染效率，為基因治療提供了一個良好的載體。

六、小結與展望

總之，氣囊作為一種新型的造影劑載體，具有其獨特的結構與性質，且易于修飾，是制備具有超聲、MRI、OCT、熒光等成像能力的多模態造影劑的理想材料，但現階段想要投入臨床應用仍面臨許多挑戰：目前基于氣囊的影像造影劑尚處于實驗階段，研究模型大多為細胞和動物模型，其在人體應用的安全性尚有待驗證；另外，如何從基因水平對氣囊進行優化，制備出針對各種成像方式具有最佳性能的氣囊尚有待研究。氣囊作為造影劑及治療載體具有很大應用潛力，隨著研究的深入，其在疾病診療、分子生物研究中將發揮廣泛的作用。