牛凍精技術研究進展

馬莉欣，戴雁峰，2

（1.內蒙古大學生命科學學院，呼和浩特 010021；2.內蒙古福瑞錦牧業有限公司，呼和浩特 010105）

近年來，人工授精（Artificial insemination，AI）、體外受精（In vitro fertilization，IVF）等輔助生殖技術（Assisted reproductive technology，ART）有效地促進了畜牧業的發展，尤其是在大規模、集約化和專業化生產領域。

精液冷凍技術是關鍵的輔助生殖技術之一，主要是指人工采精后，利用稀釋液將原精液等溫稀釋，進行平衡處理后快速冷凍，并在液氮中長期保存。目前精液冷凍技術采用的模式多為顆粒冷凍精液和細管冷凍精液。隨著體外儲存和遠距離運輸技術的顯著提升，精液冷凍技術通過遺傳資源的跨區域交流改善了群體繁殖［1］。在實際生產過程中，可以將長期冷凍保存的牛凍精復蘇后，檢查處理精子活力，人工輸入發情母牛生殖道內，使其受胎。目前該項技術是最新的人工授精技術，能夠長時間保存優質種公牛的精液，不受時間、地域限制，可最大程度地發揮出優質種公牛的繁育能力［2，3］。

但是需要指出的是，在哺乳動物精子冷凍保存、復蘇過程中，由于活性氧（Reactive oxygen species，ROS）產生不平衡和氧化應激增強而導致的冷凍損傷嚴重降低了精子功能和存活率，從而導致精液質量惡化［4］。氧化應激主要由ROS的過度產生或抗氧化能力的降低引起，在冷凍保存過程中會降低精子的活力、線粒體活性以及膜通透性，進而引發的DNA鏈斷裂及Ca2+、K+水平增加導致精子活力下降，使其受精能力顯著降低［5-10］。尋找更好的精液冷凍保存系統以提高精液質量和最佳妊娠率一直是研究人員和育種者的長期追求，本文對當前牛精液冷凍技術進行了概述，以期為后續實際生產、應用提供理論依據。

1 牛凍精技術發展及優點

在20世紀50年代，Fraser等［3］首先開展了牛冷凍精液技術，這項技術的提出符合家畜育種的迫切需要，并且是建立在人工授精發展的基礎上，作為精液長期保存的解決方案，牛凍精技術的實施使得家畜的繁殖育種和人工授精技術得到了快速的發展，也使得全國養殖場之間的協作能夠快速、大規模且有計劃的開展。

與此同時，在家畜養殖中，牛凍精技術使得個體飼養戶及企業經濟效益得到極大的提高，家畜養殖若采用自然交配的方式繁衍后代，1頭公牛1年大約只能配種25頭左右的母牛。若采用精液低溫或常溫的保存方式再進行人工授精，1頭公牛1年大約能配幾百頭左右的母牛，而利用冷凍方法保存的精液進行人工授精，1頭品種優質的公牛1年能配種幾千甚至上萬頭的母牛。

近年來隨著化工技術、生物化學、生理學、物理學等學科的高速發展，使得牛精液在冷凍、保存、運輸方面不僅提供了理論以及技術上的支持，還使這項技術得到了快速的發展。目前，牛凍精輸精技術可以隨時隨地開展，擺脫了種牛壽命的限制，使得家畜繁殖育種的工作速度和工作質量都得到了提高。此外，牛凍精技術還具有擴大配種數量、提高優秀種公牛的有效利用、減少種公牛的飼養、防治疾病、提高受胎率、消滅不孕、遠距離運輸等諸多優點［11］。

2 不同牛凍精技術的優缺點

常規緩慢冷凍（程序化冷凍）和玻璃化冷凍是牛凍精技術的主要方法。作為最常用的技術，程序化冷凍以1~2℃/min的降溫速度將精子冷卻至-196℃。這種傳統冷凍方法的缺點主要是在冷凍過程中細胞內冰晶的異常產生，其次是由于潛熱耗散不足導致的細胞機械性損傷；細胞內冰晶會破壞細胞骨架，而細胞外冰晶會增加溶質濃度和滲透壓，引發細胞失水，進一步導致精子活力下降。與此同時，程序化冷凍也導致精子復蘇后獲能不足的現象［11，12］。

玻璃化冷凍法是先在溫度較低的環境下把濃度高的冷凍保護劑凝固，這樣固體形態變成不太規則的玻璃化形態，能夠保存液體分子和離子的正常分布。所以細胞內有玻璃化產生時，玻璃化冷凍能夠起到保護細胞的作用。目前牛精子、卵子和胚胎的冷凍保存技術發展迅速，但是并未實際應用到生產中，相關機制正在研究中。根據目前研究結果，玻璃化冷凍優于常規化冷凍，有希望應用至未來的牛精液凍存中。

3 牛精液凍存、復蘇過程中的損傷

牛精液凍存、復蘇過程中，代謝途徑、酶和抗氧化劑活性的改變導致精子質膜結構的破壞，降低了精子壽命和受精能力，主要的損傷誘因有如下幾點。

3.1 滲透脅迫

低溫保存引發的冷卻壓力改變精子內的滲透壓［13］，最終導致冷凍精液質量下降。精子體積小，表面積大，凍存導致其黏度在玻璃化轉變溫度中發生轉變，促進細胞外冰晶的形成［14］。冰晶的形成增加了精子外溶質濃度（如糖、鹽和蛋白質），進而改變了細胞內外滲透壓，導致細胞脫水［15］。研究報道指出，凍存中精子的脫水程度與溫度下降程度呈負相關［16］，雖然溫度下降速率增大，細胞內脫水程度降低，但是溫度下降速率過高時，精子內細胞冰晶的產生水平增強，引發了對細胞膜和其他細胞內成分的物理損傷，導致細胞死亡［17］。

3.2 氧化應激

在冷凍保存過程中，線粒體膜流動性和精子膜磷脂結構的變化均會導致精子內ROS的生成，從而引發細胞內的氧化應激，破壞精子內的碳水化合物、脂質、蛋白質和核酸的結構及功能［18］。

3.3 生物物理和超結構變化

富含多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid，PUFA）的牛精子質膜由于極易發生過氧化，是冷凍保存過程中受損的主要部位［19］。凍存操作引發的異常脂質過氧化、冰晶形成和滲透梯度會導致精子細胞膜的不可逆損傷。冷凍和復蘇過程中的溫度和滲透效應導致的精子含水量改變使精子暴露于高鹽濃度下，該過程產生的機械應力導致了質膜的不對稱性。

與此同時，降溫過程也會導致精子細胞膜磷脂橫向運動受限，引發脂質聚集及蛋白質的不可逆聚集，從而改變細胞膜結構［20］。此外，精子頭部質膜結構重組和磷脂運動受限與冷凍導致的磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺外化密切相關［21，22］。精子頭部質膜的結構重組破壞了公牛精子與雌性生殖道中的卵母細胞正常融合的能力。

此外，降溫過程也會導致精子內細胞器的超微結構損傷，使得復蘇后的精子容易出現大體形態缺陷、頂體異常、線粒體活性降低、ATP生成減少等問題，而且細胞完整性、活力、運動性和受精能力也大幅度下降［23，24］。

3.4 分子改變

凍存過程中，滲透性和溫度的變化導致精子脂質和蛋白質結構的重組，從而降低了精子的受精潛能。與此同時，凍存對細胞的表觀遺傳因素如DNA甲基化和組蛋白修飾也有顯著調控作用，凍存、復蘇等操作顯著改變了精子的轉錄組學特征和復雜生理學，也可導致非編碼RNA表達模式的改變，進而基于基因轉錄、蛋白修飾水平引發細胞凋亡。

冷卻應力、細胞收縮、氧化應激、滲透壓變化和DNA修復酶的異常也可能導致細胞核DNA的不穩定性，在牛精液冷凍中具體表現為染色質松弛、DNA斷裂及碎片化，從而導致父系遺傳信息的不準確傳遞，嚴重時可導致胚胎植入受損及妊娠失敗。

3.5 細胞凋亡

凍存可觸發精子的凋亡，在人類、豬及牛的凍存精子中可以檢測到膜磷脂酰絲氨酸易位，進而引發細胞凋亡，具體表現為線粒體膜電位降低、半胱天冬酶激活、細胞體積減少、DNA斷裂和膜通透性增加［25］。

3.6 代謝改變

凍融損傷改變了機體的能量來源和生理功能，精子細胞需要來自稀釋液的持續能量供應，并且隨著運動能力的增強，這種需求顯著增加。營養素在細胞內代謝，通過糖酵解、檸檬酸循環和氧化磷酸化產生富含能量的ATP，但該過程受到各種冷卻壓力的阻滯，由于糖酵解過程的臨界性，凍存后精子內的ATP濃度降低，AMP/ADP轉化率增加，損害了精子的基本功能［26，27］。

4 提高牛凍精改良受胎率的關鍵技術措施

4.1 做好發情鑒定

在牛凍精輸精前，應該做好受體的發情鑒定，避免輸精后個體妊娠失敗。

4.1.1 發情前期發情前期是母牛發情的一個準備階段。此時期母牛通常會有一點煩躁不安的癥狀，并且慕雄。這個時期通常持續3~5 d，其中最為明顯的表現是在母牛的陰道中會流出較稀且黏的液體，而且陰戶也會慢慢變大。

4.1.2 發情高潮發情高潮是母牛的性欲最為強烈的時期，這個時期是母牛整個發情階段生理變化最為明顯的時候，在此時期母牛會有激動、情緒不安、經常發出叫聲、食欲不振，最明顯的癥狀是陰道部位有透明類似纖維狀的較黏的液體流出，且外陰處有腫脹。這個時期通常持續時間只有12~18 h。

4.1.3 發情末期發情末期時，母牛的各種表現都發生了改變，首先陰道部位透明類似纖維狀的較黏的液體分泌量減少，顏色逐漸加深，最后變成乳白色。情緒方面也不再有興奮不安的狀態，逐漸平靜，外陰處的腫脹也逐漸消失。

4.1.4 休情期這時母牛的性欲已經消失，這個時期通常持續時間能夠達到10~14 d。

4.2 輸精判斷

4.2.1 準確掌握輸精時間授精操作人員可以利用直腸檢查法來判斷母牛卵泡的發育情況準確掌握輸精時間，摸卵泡時能夠感受到波動感，卵泡具有脆弱感時即可說明此時卵泡發育狀態適合輸精。

通常情況下，母牛的發情時間大概是4~18 h，發情之后就是排卵的時間，即在發情后的10~12 h，大概是在發情末期外陰處的腫脹也逐漸消失癥狀出現之后。對于不同年齡的母牛配種時間也要有所調整。通常情況下，年齡較大身體素質相對較差的母牛發情時間較短，而且排卵的時間相對又早，要盡量把配種時間提前。年輕體壯的母牛發情時間較長，而且排卵時間相對又晚，要盡量把配種時間延后。

4.2.2 準確掌握輸精部位由于母牛最適合輸精的部位是子宮體，所以通常人工授精時就將精液輸入該部位。假如輸精的時間相對較晚，可將精液輸在具有排卵功能卵巢側的子宮角內。

4.3 人工授精技術

4.3.1 輸精器械及操作人員的準備

4.3.2 發情牛保定與消毒把適合輸精的母牛放入配種專用的保定架里，之后再由工作人員將其尾巴用栓尾繩拴住并且系在高處或直接拉住母牛尾巴。此時其他工作人員先用干凈的溫度適宜的水清洗該母牛外陰部位，再將外陰處消毒，消毒可用酒精棉球輕輕擦洗或使用0.1%的高錳酸鉀溶液清洗。

4.3.3 精液細管裝槍將解凍后的精液取出，用消過毒的棉布將細管外部的液滴擦掉，再用消過毒的剪刀將封口剪掉，剪刀應距封口頂端1.3 cm左右，之后把具棉塞一端裝進輸精槍中，注意要平行裝入。剪口一端要和輸精外套管緊密連接，以防精液回流至輸精外套管里面，在此過程中，務必避免任何可能對母牛的生殖道造成污染的操作。

4.3.4 輸精輸精時通常采用直腸把握輸精法，在此過程中，注意避免空氣進入直腸引起直腸膨脹，導致受體不適的情況。同時，在輸精器接近子宮頸外口時，用把握子宮頸的手向陰道方向牽拉子宮頸，使其接近輸精器前端，避免輸精器損傷子宮頸。在輸精過程中，輸精器前進方向、回抽、擺動、滾動等需要靈活掌握，避免受體不適造成輸精失敗。

輸精操作結束后應做好記錄，記錄要及時、詳細，如牛編號、胎次、上次產犢時間、發情時間、配種時間、配種次數、精液用量、配種人員、公牛精液等信息。

5 結語

在廣大基層地區積極推廣凍精改良技術，是牛養殖產業不斷向前發展的重要舉措。積極推廣牛凍精改良技術，可在短時間內實現優質種公牛精液的快速普及，快速覆蓋，提高優質種公牛的利用效率，降低養殖場購買種公牛的經濟成本。對于養殖規模較大的養殖場和養殖戶，應用該項改良技術具有顯著的經濟效益，能有效增加繁殖母牛的受胎率，及時發現不健康的種公牛精液，避免繁殖系統疾病的傳播蔓延。