牛卵母細胞玻璃化冷凍研究進展

李麗萍，戴雁峰，2

（1.內蒙古大學生命科學學院，呼和浩特 010021；2.內蒙古福瑞錦牧業有限公司，呼和浩特 010105）

近年來，卵母細胞冷凍技術為眾多有生育欲望的女性提供新途徑的同時，也有效促進了畜牧業的高速發展。相比于先前的慢速冷凍法，現如今廣泛應用的玻璃化冷凍法使細胞的冷凍技術更加成熟。但在玻璃化冷凍的過程中，由于超低溫及高濃度的冷凍劑所帶來的物理、化學損傷對卵母細胞內的細胞器及各部分結構造成不可逆的損害，進一步導致細胞的發育潛能及表觀遺傳損傷。本文探討了玻璃化冷凍對牛卵母細胞的損傷以及目前常用的改善方法，以期降低牛卵母細胞玻璃化冷凍帶來的損傷。

1 卵母細胞玻璃化冷凍研究發展概況

卵母細胞的冷凍保存為體外受精、核移植等技術的發展提供方便，還為瀕危物種提供了一種全新的繁殖途徑。同時，人卵母細胞冷凍技術的開展、實施也解決了凍存胚胎帶來的倫理問題。

1977年，Whittinham［1］首次將小鼠卵母細胞取出后進行體外凍存，獲得了健康的子代。玻璃化冷凍法主要是利用冷凍液經過迅速冷卻，使細胞直接形成為不規則的形態，此方法能夠維持細胞正常的離子、分子等的分布。

玻璃化冷凍技術在人類生殖保護及畜牧繁殖領域較為成熟。但是，各項研究表明，不同卵母細胞冷凍后的發育潛能區別較大。由于卵母細胞為單細胞、表面積與體積之比大、細胞內結構復雜等特點，其在冷凍復蘇過程中困難重重。

關于人類和其他哺乳動物卵母細胞凍存的研究表明，冷凍造成的極端環境會對參與調控的DNA結構、細胞周期、線粒體穩態、產生能量的基因及蛋白的表達以及透明帶、肌動蛋白絲、紡錘體、線粒體等細胞結構和維持鈣穩態、皮質顆粒的誘導和釋放等細胞功能均產生負面影響。

2 目前常用的玻璃化冷凍方法

2.1 開放式拉長管（Open pulled straw，OPS）

OPS是一種目前應用廣泛的冷凍方法，這種方法解凍后的卵細胞具有更高的受精率。通過虹吸作用可以將加入冷凍液的卵母細胞吸入加熱拉制而成的OPS管內，然后直接置于超低溫的液氮內。解凍方法為直接將OPS管浸泡在38℃解凍液內，可以快速解凍釋放卵細胞。這種方法冷凍和解凍速度極快，能夠有效降低卵母細胞的損傷，使用OPS法凍存牛卵母細胞，相比于新鮮胚胎存活率雖略有下降，但胚胎率仍高達25%［2］。

2.2 玻璃微管（Glass micropipette，GMP）

該方法是由毛細玻璃管加熱拉制而成的，又稱為毛細玻璃管法。Kong等［3］最早是在胚胎上應用GMP法得到了較理想的結果。與OPS相比，GMP熱傳遞效果更好，且可以避免解凍時管漂浮的問題，但缺點是易造成細胞的丟失［4］。許衛華等［5］研究表明，GMP在一定程度上減少了冷凍所帶來的細胞損傷。

2.3 冷凍環法（Cryoloop）

Cryoloop以尼龍環作為載體，冷凍時將細胞轉移至薄膜上，后置于液氮中冷凍保存。Lane等［6］試驗表明，使用該方法的囊胚率高達54.2%。Gasparri?ni等［7］利用該方式凍存水牛的卵母細胞，解凍后的細胞卵裂率高達45%，并獲得了體外成熟的牛囊胚胎。相較于OPS法，它的降溫速度更快，有利于減少冷凍所帶來的卵母細胞損傷。

3 冷凍對卵母細胞的損傷

玻璃化冷凍在各類卵母細胞的凍存過程中應用普遍，但是在冷凍過程中，對卵母細胞產生的損傷是無法規避的。牛卵母細胞對于降溫極為敏感，冷凍保護劑的化學毒性以及解凍過程中滲透壓的變化等都對卵母細胞造成損傷。

3.1 對卵母細胞結構上的損傷

卵母細胞是單細胞，細胞的表面積與體積之比大，冷凍劑易滲入卵細胞內對其造成物理性的損傷。在凍存過程中，細胞內外滲透壓的變化會破壞細胞膜結構。另外，具有毒害作用的冷凍液在穿過細胞膜的過程中也會破壞細胞膜的結構。

透明帶是保證卵母細胞正常受精的重要結構。冷凍過程中，細胞的皺縮和變形會導致顆粒細胞的提前釋放，發生透明帶反應。另外，冷凍會使透明帶變硬，這些都會導致細胞卵裂率、囊胚率等下降以及多精入卵率的上升［8］。

3.2 對卵母細胞氧化應激上的損傷

冷凍后的卵母細胞的細胞器都會受到損傷，首先是線粒體的密度降低，嵴出現泡狀，但在復蘇后泡狀化會消失。因此，線粒體的損傷會影響卵母細胞的生長發育但不致死。其次，細胞核中的核纖層會被損壞，這就使基因表達受到影響。

Cheiler等［9］在復蘇的卵母細胞的細胞質內發現了低密度的小泡，這表明在凍存過程中細胞質結構發生了損傷。另外，細胞內的某些細胞器如線粒體、細胞骨架等也會受到損傷。

微管可形成紡錘體，其在細胞分裂時牽引染色體移向細胞兩極。超低溫會導致微管發生解聚，導致紡錘體形態不穩定［10］。有研究表明，冷凍后會出現紡錘體退化、畸形等現象，且解凍后不能恢復，這導致染色體無法準確的移向細胞兩極［11］。

3.3 對卵母細胞發育上的損傷

相對于技術成熟的胚胎冷凍而言，卵母細胞凍存技術還需要進一步的探討。卵母細胞為單細胞，表面積與體積之比大，且細胞內的結構復雜，對低溫更敏感等種種因素致使卵母細胞的凍存難度加大。卵母細胞在冷凍解凍的過程中，經歷的高濃度冷凍液的毒害作用以及超低溫都會影響細胞的發育潛能。

3.4 對卵母細胞表觀遺傳上的損傷

作為表觀遺傳的重要表達方式，DNA甲基化可以通過DNA甲基轉移酶在CpG二核苷酸序列的胞嘧啶5'碳位連接一個甲基基團，在卵母細胞的凍存過程中DNA甲基化表達模式會發生系列的變化，進而調控復蘇后的卵母細胞發育、胚胎發育及子代表型。

研究發現，冷凍后的小鼠卵母細胞中全基因組DNA甲基化水平明顯降低，導致卵母細胞的發育能力降低［12］。張培培等［13］分別對新鮮和玻璃化冷凍的牛卵母細胞的全基因組甲基化水平分析，結果表明冷凍并不會對GV期牛卵母細胞的甲基化水平產生影響，但是對解凍后的GV期細胞體外成熟至MⅡ期后進行全基因組的甲基化水平分析時發現冷凍后牛卵母細胞甲基化水平顯著降低，從而影響了牛卵母細胞的發育能力。

4 冷凍保存技術的改善

4.1 卵母細胞注射調控手段

葉酸受體4（Juno蛋白）。Bianchi等［14］發現Juno是受精過程中的關鍵蛋白。郝彤［15］通過反轉錄技術及顯微注射技術，將Juno mRNA注射到卵母細胞中，進一步探討了在玻璃化冷凍過程中，Juno蛋白對牛卵母細胞的影響機制。試驗結果表明，向牛卵母細胞中注射200 pg Juno mRNA時可顯著增強卵母細胞受精率、卵裂率和囊胚率等，這為玻璃化冷凍牛卵母細胞提供了新的技術手段。

4.2 凍存液成分添加抗凍保護劑

在玻璃化凍存過程中，卵母細胞可能會受到不可逆的損傷，無法修復，因此在牛卵母細胞凍存液中添加抗凍保護劑以防止凍存過程中細胞損傷是改善牛卵母細胞凍存體系的重要理論來源。

4.2.1 細胞松弛素B（Cytochalasin B，CB）CB作為一種微絲穩定劑，可以增加細胞骨架的彈性，緩解凍存導致的細胞損傷［16］。郭娟等［17］發現添加20μg/mL CB可以有效地改善牛卵母細胞的冷凍效果。Zhou等［18］發現冷凍前添加CB可以通過介導牛卵母細胞微絲的穩定性促進牛卵母細胞凍存效果，與王彩玲［19］、卞桂華等［20］研究結果一致。但郭娟［17］、Sripunya等［21］、Liang等［22］及Yamada等［23］的研究指出CB對牛卵母細胞的凍存保護效果并不適應于未成熟的牛卵母細胞，其具體機制及差異有待深入研究。

4.2.2 紫杉醇（Taxol）紫杉醇能夠阻止微管的解聚，使得細胞內微管二聚體的結合更加緊密，在冷凍的過程中能夠避免超低溫所帶來的微管損傷［18］。Park等［24］在對小鼠卵母細胞冷凍的研究中首次發現了紫杉醇對小鼠卵母細胞的保護作用；張家新等［25］發現紫杉醇處理雖然不能使綿羊卵母細胞存活率有所提升，但是0.5μmol/L紫杉醇處理后的綿羊卵母細胞囊胚率得到了有效改善。

Shayegh等［26］發現紫杉醇處理對牛卵丘復合體的凍存沒有顯著的促進作用，但Morató等［27］在玻璃化冷凍前用紫杉醇處理牛卵母細胞，結果表明在冷凍液中加入1μmol/L紫杉醇顯著增強了牛卵母細胞的發育潛能。與此同時，Morató等［28］同樣發現冷凍過程中添加紫杉醇可以有效地維持牛卵母細胞的紡錘體的形態，與Pitchayapipatkul等［29］研究結果一致。

4.2.3 抗冷凍蛋白（Antifreeze protein，AFP）AFP最初是在深海魚中提取的一種蛋白類物質，能夠有效地抑制冷凍過程中細胞內冰晶的產生，復蘇回溫過程中，該蛋白類物質又進入失活狀態［30］。目前已鑒定出的AFP有5種，分別為抗凍糖蛋白（Antifreeze glycoprotein）、AFPⅠ、AFPⅡ、AFPⅢ、AFPⅣ。Knight等［31］首次發現在細胞的凍存過程中添加AFP可以有效地保護細胞結構，從而減少冷凍過程對細胞結構造成的損害，而且添加AFP的保護效果已經在斑馬魚、山羊、猩猩、老鼠、兔子、水牛等生殖細胞、胚胎的冷凍過程中得到證實［32］。

Liang等［33］發現冷凍過程中添加抗凍糖蛋白可以有效地抑制因冷凍過程導致的活性氧積累、DNA斷裂、細胞自噬、肌動蛋白損傷等現象，而且抗凍糖蛋白的添加可以有效地維持牛卵母細胞內的紡錘體組裝、染色體排列及線粒體活性水平，從而顯著提高牛卵母細胞的存活率，而且體外受精后牛卵母細胞的發育潛能得到有效地改善。

王勇杰等［34］分別在牛卵母細胞冷凍保護液中添加了不同濃度的AFPⅢ。試驗結果表明，對于GV期卵母細胞，添加500 ng/mL AFPⅢ，可以有效地促進牛卵母細胞復蘇后的發育潛能。而在MⅡ牛卵母細胞的玻璃化冷凍過程中，添加750 ng/mL AFPⅢ可以有效地促進牛卵母細胞復蘇后的發育潛能，這表明添加AFPⅢ可以有效地降低細胞冷凍過程中卵母細胞的損傷。

4.2.4 釕紅（Ruthenium red，RR）玻璃化冷凍后，卵母細胞內的線粒體受到損害，導致細胞內Ca2+水平升高，RR能夠調控Ca2+水平從而改善卵母細胞解凍后的損傷。王娜等［35］通過往牛卵母細胞冷凍液中加入不同濃度的RR，檢測線粒體內的Ca2+水平及解凍后的卵裂率、受精率、囊胚率、發育等情況，結果表明冷凍液中添加2μmol/L的RR能夠顯著改善冷凍對細胞的創傷，抑制細胞的凋亡，可以有效地促進牛卵母細胞冷凍效果。

5 結語

玻璃化冷凍技術雖然已經被廣泛應用于牛卵母細胞的長期保存，但目前主要集中于對MⅡ和GV期細胞卵母細胞的研究。冷凍過程中不可避免的會發生細胞結構、氧化應激上的損傷。因此需要通過各種不同的調控方式來改善卵母細胞的凍存，主要包括對卵母細胞本身蛋白水平的調控以及凍存液成分的改善等手段來有效改善卵母細胞的冷凍保存方法。