棉花耐鹽性研究進展*

王俊鐸，黎玉華,龔照龍，梁亞軍，艾先濤，郭江平，買買提·莫明，李雪源，鄭巨云

(1.新疆農業科學院經濟作物研究所，新疆 烏魯木齊 830091；2.新疆博樂市種業發展中心，新疆 博樂 833400 )

新疆是我國最主要的棉花產區，新疆棉花生產直接影響我國棉花生產安全和棉花的有效供給。2018 年新疆棉花種植面積249.14萬hm2，占全國總面積的74.31%，比2017年增長9.22%。2018年新疆棉花總產511.1萬t，占全國的83.8%[1]。據統計，新疆鹽堿土的面積為2 181.4萬hm2，占全國鹽堿土面積的22.01%，在新疆地區407萬hm2耕地中，不同程度鹽漬化的耕地達122.88萬hm2，棉花的種植受到了較大的影響。研究棉花的耐鹽脅迫機制，選育耐鹽種質資源，挖掘鹽漬化耕地的生產潛力在維持棉花增產、穩產中發揮重要作用，已成為高度關注的熱點問題。因此，作者結合目前已報道的鹽脅迫下棉花的生長發育、作用機制以及挖掘的相關耐鹽基因，綜述棉花的耐鹽性研究情況，旨在充分利用和發揮棉花抗旱、耐鹽、耐瘠薄的能力，推廣鹽堿地和瘠薄地植棉，保障棉花有效供給，促進棉花產業可持續發展。

1鹽脅迫對棉花的影響

1.1鹽脅迫對棉花種子萌發的影響

鹽脅迫對植物種子萌發有抑制作用，在鹽濃度(質量分數，下同)≤ 1.2%時，所有棉花品種萌發受到的影響差異較?。畸}濃度≥1.2%時品種間發芽率出現差異，后期生長受到抑制；低濃度的NaCl能促進棉花種子萌發，而高濃度則顯著抑制[2]。在NaCl、Na2SO4和Na2CO3+NaHCO3三種鹽堿脅迫中，棉花種子發芽系數、日均發芽率、相對發芽指數、相對發芽勢和相對發芽率隨著鹽分濃度増大均呈下降趨勢；且相同濃度Na2SO4脅迫比NaCl脅迫更嚴重[3]。在鹽脅迫下棉花種子發芽率、發芽勢、胚根長、種子萌發后的生物量均明顯下降，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)和過氧化氫酶(Catalase，CAT)的酶活性顯著降低，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量明顯增加[4]。

1.2鹽脅迫對棉花生長生理的影響

鹽脅迫導致棉苗生物量減少，滲透調節物質、H2O2、MDA含量、電解質滲出率和O2-產生速率增加[5]。鹽堿脅迫主要影響棉花的葉片K+/Na+比值、根長、地上部鮮重、地上部干重和葉片胞間CO2濃度，為了降低鹽脅迫的傷害程度，可以適當添加棉粕，增加鹽堿脅迫下棉花不同器官對K+的吸收，降低對Na+的吸收，維持鹽堿脅迫下細胞內K+和Na+的平衡，從而顯著促進棉花生長，提高葉片葉綠素含量和光合作用效率，有效緩解鹽堿脅迫對棉花的傷害[6]。棉花葉片中的細胞器對鹽分的敏感程度不同，最敏感的葉綠體，其次是線粒體，在脅迫初期幼苗子葉SOD活性較高，隨著脅迫濃度增加，脅迫時間增長，SOD活性下降，導致葉片質膜通透性增加，從而危害葉細胞的膜系統，進而影響光合和呼吸作用[7]。利用 NaCl、Na2SO4以及NaCl+NaHCO3(物質的量1∶1)混合成的中性鹽對海島棉進行處理，發現高鹽濃度下，海島棉株高、根系生物量及莖葉生物量與鹽濃度呈顯著負相關，且堿性鹽對于海島棉幼苗的傷害遠大于中性鹽[8]。NaCl脅迫過程中棉花葉片中的Na+通道蛋白、MAD含量增加；在使用油菜素內酯(Brassinolide，BR)后，棉花葉片中的Na+積累降低，脯氨酸含量增加，MDA含量降低，可以緩解NaCl脅迫，提高NaCl脅迫下棉花的生物產量[9]。

1.3鹽脅迫對棉花品質的影響

鹽脅迫對棉花的纖維細度、強度、成熟度影響較大。1986年Krth等研究發現NaCl脅迫過程中主要影響棉花分生組織細胞發育。葉武威[10]研究表明土壤中的鹽分可以促進棉花纖維的增長，提高棉花纖維長度和降低馬克隆值及細度，同時鹽脅迫過程中棉鈴發育受到抑制，鈴重、種子重量有所下降，纖維中糖分含量增加，纖維素含量降低，含水量上升。這主要是由于脅迫過程中棉花生育期延長，棉鈴內部滲透勢小，鈴殼失水、開裂早，花鈴期縮短，導致棉鈴及纖維發育不充分，糖分轉化率下降。

2耐鹽脅迫的相關基因

2.1離子轉運相關基因

目前研究成果與離子轉運相關的基因主要有兩大類，一類是編碼 Na+/H+逆向轉運蛋白基因，另一類是編碼 K+、Na+轉運蛋白基因。在擬南芥中質膜Na+/H+反轉運基因 AtSOS1 ，是SOS(The Salt Overly Sensitive)信號轉導途徑的一個組成部分。從陸地棉耐鹽基因型中克隆了一個質膜Na+/H+逆向轉運基因GhSOS1，在NaCl(200 mmol/L)脅迫過程中GhSOS1在棉花根系中的表達水平顯著上調，GhSOS1蛋白定位于質膜，在擬南芥中的過表達，GhSOS1增強了擬南芥對鹽脅迫的耐受性，表現為轉基因植株中MDA含量降低，Na+/K+比值降低。此外，在GhSOS1高表達系中鹽脅迫相關基因的轉錄水平顯著高于鹽處理的野生型植株；GhSOS1可能是提高轉基因棉花耐鹽性的潛在靶基因[11]。利用農桿菌介導轉化系統，將質膜Na+/H+逆向轉運基因K2-NhaD導入陸地棉R15中，K2-NhaD在溫室條件下和鹽堿脅迫下均過表達，使轉基因棉花葉片的相對含水量、葉綠素、可溶性糖、脯氨酸水平以及SOD、CAT和POD活性顯著高于非轉基因棉花。從棉花cDNA文庫中分離到一個GhNHX1，GhNHX1在酵母Na+/H+逆向轉運突變體中表現為功能互補，過表達GhNHX1的轉基因煙草植株也比野生型煙草具有更高的耐鹽性。鹽誘導下耐鹽棉品種ZM3中GhNHX1 mRNA水平分別是鹽敏感棉品種ZMS17和ZMS12的3倍和7倍[12]，GhNHX1的過表達在棉花的耐鹽性中起著重要作用。

鉀離子轉運蛋白HAK/KUP/KT家族屬于氨基酸多胺有機陽離子超家族，是一類具有二次活性的轉運載體，在細菌、真菌和植物的跨膜轉運中有著廣泛的應用[13]。植物基因組中含有大量的HAK/KUP/KT轉運蛋白基因，在K+吸收和轉運、耐鹽性和滲透勢調節以及控制根系形態和地上部表型等方面發揮作用[14]。

2.2滲透調節相關基因

滲透調節相關物質主要有游離脯氨酸、MDA、可溶性糖(Soluble sugar)、甜菜堿(Betaine)等。脯氨酸是植物細胞應對非生物脅迫產生的一種有機化合物。在鹽脅迫過程中，植物組織脯氨酸含量增加，清除O2-自由基，調節滲透壓，保證細胞膜的完整性，防止質膜透性的變化。谷胱甘肽轉移酶(glutathione S-transferase，GSTs)是脯氨酸的合成底物谷氨酸的主要來源，研究發現含有柑橘谷胱甘肽轉移酶(CSGSTUS)的轉基因煙草具有一定的耐鹽性，說明CsGSTUs的過表達有助于開發高抗非生物脅迫的轉基因作物。鹽脅迫過程中，植物葉片的丙二醛含量與其耐鹽性呈負相關，這一結論在棉花、樹木幼苗、番茄、馬鈴薯、菊芋、甜高粱、白刺和燕麥等作物中得到驗證[16-23]，丙二醛的積累會導致O2-自由基離子增加，膜脂過氧化，植物耐鹽性降低，丙二醛積累量越大，品種耐鹽性越差[18, 24-26]。在鹽脅迫過程中，耐鹽性強的小麥葉片中可溶性糖含量高于耐鹽性弱的品種[27]。在鹽脅迫下小麥大量積累脯氨酸和可溶性糖等有機溶質[28]。在主要造林樹種鹽脅迫響應及耐鹽機理研究中表明樹木利用可溶性糖的積累來調節耐鹽性[29]。甜菜堿可以有效地保護高等植物細胞膜的滲透勢，Lai等將編碼甜菜堿生物合成酶Mpgsmt和Mpsdmt的基因導入擬南芥并鹽脅迫后表明，轉基因植株表現出較強的耐鹽性[30]。

2.3抗氧化性相關的酶基因

在鹽脅迫過程中，植物組織中活性氧(ROS)增加，超氧化物歧化酶(SOD)可以有效清除ROS因子來提高植物的耐鹽性，而CuZnSOD和抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidases，APX)是氧化應激引起的活性氧的第一道防御途徑。Yan等將CuZnSOD和APX導入鹽敏感甘薯，在鹽脅迫下，野生型植株的生根明顯受阻，而轉基因植株均顯著促進了根系的生長，且轉基因植株的SOD、APX活性升高，說明CuZnSOD和APX對提高甘薯的耐鹽性具有重要作用[31]。Negi等將AhCuZnSOD基因導入煙草，轉基因煙草植株的SOD酶活性增加，增強了煙草的耐鹽性[32]。Zhang等采用高通量測序技術研究了鹽脅迫下堅果類植物的轉錄特性，表明在鹽脅迫下植物激素信號通路的激活起著促進植物細胞保護和清除活性氧的兩種主要抗氧化防御系統(即抗氧化酶和類黃酮)的作用[33]。

APX在植物抗氧化系統中發揮重要作用，是細胞水平調節抗氧化系統的關鍵因子。Duan等將番茄類囊體抗壞血酸過氧化物酶基因(LITAPX)導入到番茄中，LetAPX的過表達，番茄葉片中的還原型谷胱甘肽(Glutathione ，GSH)含量和葉綠素含量增加，APX活性增強，耐鹽性增強[34]。Liu等將JctAPX 基因轉入煙草，轉基因植株葉綠素含量增加，APX 酶活性增強，耐鹽性增加[35]。Shafi等研究表明，PaSOD和RaAPX過表達不僅在氧化氫信號傳導中起主要作用，提高SOD和APX酶活性，而且通過轉錄激活纖維素生物合成途徑，增強植物纖維素生物合成，提高植物在鹽脅迫下產生生物量[36]。

2.4信號傳導與表達調控相關基因

植物在應對非生物脅迫中只要是由信號轉導起主要作用，而轉錄因子參與信號轉導， ERF(Ethylene-responsive factor)、DREB(Dehydration responsive element binding protein)等轉錄因子在鹽脅迫過程中誘導表達，提高植物的耐鹽性[37-38]。Yang等分離并鑒定了與ERF家族相關的JcERF1基因，將該基因導入到煙草中，轉基因煙草比野生型煙草更耐鹽[39]。Li等克隆了番茄ERF基因SlERF84，并對其進行了功能鑒定，表明SlERF84作為一種應激反應轉錄因子，在非生物和生物脅迫耐受性的差異調控中發揮著重要作用[40]。Long等對鹽脅迫下的棉花葉片的轉錄組進行分析，表明在鹽脅迫下棉花差異表達基因2356個，其中9.4%為轉錄因子，在轉錄因子(222個)中39個屬于乙烯反應因子(ERF)家族，其中GhERF4L和GhERF54L在鹽處理12 h后表達增加12～15倍，對GhERF4L和GhERF54L進行沉默，棉花幼苗的耐鹽性顯著降低，表明其在調節棉花對鹽脅迫的反應中起著重要作用[41]。

DREB轉錄因子在植物逆境反應中起著重要作用，已在多種植物中得到鑒定，對DREB的研究主要集中在A-1(DREB1)和A-2(DREB2)兩個基團上。Li等對沙漠苔蘚的A-5c型DREB基因ScDREB10的耐逆功能進行了表征和分析，ScDREB10的過表達顯著提高了滲透脅迫和鹽脅迫下擬南芥種子的發芽率，提高了擬南芥苗期的耐鹽和滲透脅迫能力，與下游脅迫相關基因的表達和活性氧清除能力的提高有關[42]。Liang等研究發現一個新的a-5型DREB基因ScDREB8，該基因通過上調下游脅迫相關基因的表達和提高ROS清除能力，顯著提高了鹽脅迫下擬南芥的發芽率，提高了擬南芥幼苗期的耐鹽性[43]。Sharma等研究發現MdDREB76基因編碼是一種功能性轉錄因子蛋白，通過誘導抗氧化酶(如超氧化物歧化酶、抗壞血酸過氧化物酶和過氧化氫酶)基因的表達，來增強品種的耐鹽性[44]。

乙烯信號轉導(Ethylene signal transduction，NAC)參與鹽脅迫反應的調控。An等研究發現“MdNAC047 - MdERF3-乙烯-鹽耐受”調控途徑，轉錄因子MdNAC047在鹽脅迫下具有明顯的誘導作用，MdNAC047直接與MdERF3啟動子結合并激活其轉錄調節乙烯的產生，其高表達增強了對鹽脅迫的耐受性[45]。Lu等研究表明 PeNAC034和PeNAC045分為ATAF亞組，PeNAC036分為ANAC072亞組，在鹽脅迫過程中PeNAC036在整個植株中被強烈誘導，而PeNAC034在根和莖中被顯著抑制，PeNAC045在根中被抑制，PeNAC045的過表達導致植株的凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率顯著降低，適應高鹽環境[46]。Xu等在普通小麥中鑒定了一個NAC基因TaNAC29，與鹽脅迫、干旱脅迫和ABA脅迫有關，TaNAC29的過表達，植株葉片綠度增加、過氧化氫積累減少、細胞膜穩定性增強、SOD、POD、CAT和APX活性提高，對鹽脅迫的耐受性增強，說明TANAC29通過降低H2O2積累和膜損傷，通過增強抗氧化系統，參與調節非生物脅迫應答信號通路來賦予鹽脅迫耐受性[47]。

WRKY轉錄因子在植物發育、防御調節和脅迫響應等多種生物過程中都發揮著調節作用。Cai等研究發現玉米WRKY基因ZmWRKY17能特異性結合W-box，并能激活植物體內的W-box依賴性轉錄，在NaCl脅迫下，轉基因植株積累的ABA含量高于野生型植株，但NaCl處理后轉基因幼苗中的一些脅迫相關基因表達水平低于野生型，說明ZmWRKY17可能是通過ABA信號參與鹽脅迫反應的負調節因子[48]。Shi等研究發現GmWRKY12全長714bp，編碼237個氨基酸，歸為WRKYⅡ，可能參與脫落酸(ABA)、干旱和鹽脅迫反應，GmWRKY12的過表達增強了轉基因幼苗的耐鹽性[49]。Liang等在從菊花中分離到一個新的WRKY轉錄因子DgWRKY5，DgWRKY5包含WKYGQK的兩個WRKY結構域，在鹽脅迫下，轉基因菊花SOD、POD和CAT酶活性顯著高于WT，而轉基因菊花中H2O2、O2-和MDA的積累減少；在鹽脅迫下，轉基因菊花的根長、鮮重、葉綠素含量和葉氣交換參數均明顯優于野生菊花[50]。此外，DgWRKY5轉基因菊花中DgAPX、DgCAT、DgNCED3A、DgNCED3B、DgCuZnSOD、DgP5CS、DgCSD1和DgCSD2等逆境相關基因的表達較野生菊花中的表達上調。Bao等研究發現WRKY轉錄因子中負調控基因PcWRKY33，通過降低應激相關基因的表達和提高細胞活性氧的水平，而降低植株的鹽耐性。

3耐鹽相關基因在棉花育種中的應用

目前在植物抗逆(旱，鹽) 生物學研究方面，仍主要集中在擬南芥、煙草和番茄等模式植物。棉花中耐逆相關基因克隆及功能分析工作在最近幾年才剛開始。通過對棉花脫水蛋白基因進行了全基因組鑒定和功能鑒定，發現GhA05G1554(GhDHN03)和GhD05G1729(GhDHN04)高度上調，兩個基因的敲除，顯著降低了棉花對滲透脅迫和鹽脅迫的耐受能力[50]。Magwanga等在陸地棉中分離出了基因Gh-A05G2067(GT-2)，GT-2過表達對棉花具有較強的耐鹽性[51]。Yu等將AtEDT1/HDG11轉入到棉花中，與野生型相比，鹽脅迫后轉基因棉花葉片脯氨酸含量、可溶性糖含量和活性氧清除酶活性顯著增加；轉基因棉葉片氣孔密度顯著降低，氣孔和葉表皮細胞大小顯著增大[52]。Liang等研究表明GhABF2的過表達顯著提高了擬南芥和棉花的抗旱性和耐鹽性，且GhABF2的沉默使轉基因棉花對PEG滲透脅迫和鹽脅迫敏感，與野生型相比，GHABF2過表達棉花葉片脯氨酸含量、SOD和CAT活性也顯著提高，且在干旱和鹽堿地條件下，轉基因棉花纖維產量增加[53]。Mu等對編碼蛋白磷酸酶的GhDsPTP3a進行沉默可以增加棉花的耐鹽性，主要是由于鹽脅迫誘導ghan8b磷酸化，GhDsPTP3a使ghan8b磷酸化，GhDsPTP3a和ghan8b的表達對植物耐鹽性和鈣內流有相反的調節作用；在鹽脅迫下，GhANN8b的沉默在調節GhSOS1轉錄水平方面起相反的作用[54]。Kirungu等對基因GhA05G1554(GhDHN03)和GhD05G1729(GhDHN04)進行敲除，顯著降低了棉花對滲透脅迫和鹽脅迫的耐受能力[55]。

Sun等對713份陸地棉進行全基因組關聯研究(GWAS)，發現D09上的兩個單核苷酸多態性i46598Gh和i47388Gh同時與兩個耐鹽相關性狀，相對存活率和耐鹽水平顯著相關[56]。 Dilnur等以215份亞洲棉為材料， 分析發現7號染色體上兩個富含SNP的區域同兩個與鹽度相關性狀的相對鮮重、相對莖長顯著相關，并開發出了2個候選基因(Cotton_A_37775 、Cotton_A_35901)相關的兩個關鍵單核苷酸 (Ca7_33607751 、 Ca7_77004962)位點[57]。Yuan等采用全基因組關聯分析和RNA測序技術，對196個陸地棉種子萌發期耐鹽性品質性狀基因座和候選基因進行了檢測，利用4種環境對棉花耐鹽性綜合評價，鑒定出33個顯著的單核苷酸多態性(SNPs)，在13個QTL中，17個穩定的SNP位于98個候選基因內或附近，其中35個基因被功能性注釋為參與鹽脅迫反應[58]。張伯陽等研究表明，在鹽脅迫過程中棉花GhSEDEG38基因的表達明顯上調，構建了該基因的RNAi干涉載體并轉化棉花，鹽處理后轉基因植株的MDA含量和活性氧含量顯著高于對照材料，而可溶性糖含量顯著低于對照材料[59]。

4展望

綜上所述，目前有關鹽脅迫基因、轉錄因子已在煙草、擬南芥等植物中得到驗證，但關于棉花的轉基因植株耐鹽性的提高幅度有限，不能滿足大田應用。主要原因在于棉花在鹽堿地生長過程中是由多條代謝通路協調的結果，涉及到的基因較為復雜，實驗室轉基因植株均是單基因的表達，提高植株的耐鹽性程度有限；其次是棉花生育期較長，轉化效率低。為此應該加強各個研究單位的合作，挖掘耐鹽相關的關鍵基因及關鍵功能基因的啟動子，建立適合棉花的耐鹽基因轉化體系。同時充分利用大田環境中選擇出的優良耐鹽棉花品種，開發利用SNP標記和候選基因，挖掘耐鹽途徑，為棉花耐鹽育種奠定基礎。