基于數據挖掘和網絡藥理學探究抽動障礙專利復方的用藥規律與作用機制

王笑冉 鄭 攀 孫世杰

1.河南中醫藥大學基礎醫學院，河南鄭州 450046；2.河南中醫藥大學方劑學科，河南鄭州 450046

抽動障礙（tic disorder，TD）是兒童最常見的神經發育障礙之一，其表現為面部、四肢、軀干部肌肉不自主抽動，伴喉發異聲或穢語，常共患情緒或行為障礙，嚴重危害兒童身心健康[1]。近年來，TD 患病率逐年增加，全球學齡兒童TD 發病率為12%～16%，僅中國就有1000 多萬例患兒，短暫性和輕度抽動影響約20%學齡兒童[2-3]。

中醫學將本病歸于“肝風”“慢驚風”等范疇[4]，認為其病機特點為本虛標實，病位主要在肝，由五志過極，風痰內蘊而引發。如《小兒藥證直訣》載“凡病或新或舊，皆引肝風，風動而止于頭目，上下左右如風吹，不輕不重，兒不能任，故目連扎也”。明·王肯堂《證治準繩·幼科》曰“水生肝木，木為風化，木克脾土，胃為脾之腑，故胃中有風，瘛疭癥狀，兩肩微聳，兩手下垂，時腹動搖不已”。TD 發病機制復雜，涉及遺傳、神經、免疫、環境等因素[5]。近年來，多項研究顯示中醫藥通過辨證論治，可全方位、多靶點控制抽動癥狀，彰顯出獨特優勢[6-7]?，F通過數據挖掘分析抽動障礙專利復方的用藥規律，并結合網絡藥理學闡釋其核心藥物作用機制，以期為臨床用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 數據來源

以“抽動障礙”“中醫藥”為主題詞檢索中國知網和國家知識產權局專利數據庫（http://pss-system.gov.cn），時限為建庫至2020 年12 月31 日。納入標準：已公開的治療抽動障礙的中藥專利復方，劑型不限。排除標準：聯合用藥、單味中藥或未標明具體藥物的專利；剔除隨證加減藥物、周期用藥復方、外用復方。參照2015 版《中華人民共和國藥典》[8]對處方藥物名稱、類別進行規范化處理。

1.2 分析方法

利用SPSS 21.0、SPSS Modeler 18.0 軟件統計藥物類別、頻數并進行關聯分析，對頻數排名前20 的藥物進行復雜網絡分析和系統聚類分析。通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺、DrugBank 數據庫篩選頻數排名前5 的核心藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18[9]的活性成分及相關靶點，DrugBank、GeneCards、OMIM 數據庫獲取疾病相關靶點。將藥物和疾病靶點通過Uniprot（https://www.uniprot.org/）數據庫[10]進行標準化處理并取交集，得到核心藥物治療抽動障礙的有效靶點，并導入STRING 數據庫構建蛋白質-蛋白質相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網絡；通過Cystoscape 3.7.0 軟件行拓撲學網絡分析以評估有效靶點在全網絡中的重要程度，借助Metascape 數據庫對關鍵靶點行GO 分析和KEGG 信號通路分析。

2 結果

2.1 頻數統計

共檢索出專利復方93 個，涉及中藥243 味，總頻次1021 次；其中頻次≥15 的藥物共20 味，累計頻次561 次，占總用藥頻次的54.9%。頻數排名前5 的核心藥物為天麻、白芍、茯苓、鉤藤、石菖蒲。由于專利復方中有較多使用如刺沙蓬、寸金草等133 味特色藥，使用頻次133 次，占總頻次13.02%，其中大多未被中藥學收錄，不便于歸納，所以僅納入頻次≥2 的中藥進行類別統計。見圖1。

圖1 藥物頻數、類別統計雷達圖

2.2 關聯規則分析

通過Apriori 建模挖掘藥物的配伍關系。支持度指A 與B 同時出現的概率，置信度指當A 出現時B 出現的概率，提升度指關聯規則中A 與B 的相關性，提升度>1 且越高表明正相關性越高。設置支持度>10%，置信度>85%，提升度>1，挖掘出16 個藥物配伍。見表2。

2.3 復雜網絡分析

利用SPSS Modeler 18.0 軟件對高頻藥物進行復雜網絡分析。線條粗細表示藥物鏈接的強弱程度，強鏈接藥物組合包括天麻與白芍、鉤藤、茯苓、石菖蒲、甘草，白芍與甘草、鉤藤與茯苓、白芍與茯苓共8 個。見圖2。

圖2 高頻藥物復雜網絡分析

2.4 系統聚類分析

利用SPSS Statistics 21.0 軟件對高頻藥物進行系統聚類分析，聚類方法采用Ward 法，取類間距離為20，得到5 組藥物聚類組合分別為C1：半夏、陳皮、茯苓、石菖蒲、遠志、白術；C2：龍骨、牡蠣、膽南星、地龍；C3：天麻、僵蠶、白芍；C4：鉤藤、白蒺藜、全蝎；C5：羚羊角、地黃、防風、甘草。見圖3。

圖3 高頻藥物系統聚類分析圖

表1 藥物關聯規則分析

2.5 核心藥物活性成分及靶點收集

共篩選出核心藥物活性成分79 個，相關靶點372 個。通過Cytoscape 3.7.0 軟件構建“藥物-活性成分-靶點網絡”，對藥物活性成分及靶點（node）進行形狀顏色標注，兩者間的相互關系則用邊（edge）表示。共137 個節點，1263 條邊。見圖4。

圖4 藥物-活性成分-靶點網絡

2.6 疾病靶點收集

共得到抽動障礙相關靶點1259 個，與藥物交集靶點137 個，借助Omicshare 進行Venn 圖可視化處理。見圖5。

圖5 藥物-疾病交集靶點Venn 圖

2.7 PPI 網絡構建和關鍵靶點篩選

將137 個有效靶點導入STRING 數據庫構建PPI網絡，借助“Network Analyzer”插件進行拓撲分析，選取自由度（Degree ）、介數（Betweenness）和中心性（Closeness）都大于均值（Degree 均值為28，Betwee ness 均值為0.0074，Closeness 均值為0.5122）的靶點共34 個為關鍵靶點，并依據度值進行形狀大小標注，其中度值排名前10 的靶點為核心靶點，包括INS、AKT1、FOS、IL6、CXCL8、VEGFA、TP53、NGF、TNF、EGF。見圖6。

圖6 PPI 網絡構建及關鍵靶點篩選

2.8 GO 分析和KEGG 通路分析

通過Metascape 對34 個關鍵靶點進行GO 分析和KEGG 通路分析，以P <0.01，最小計數為3 和富集因子>1.5 為限制條件。GO 結果包括3 類：生物過程（biological progress，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular functions，MF）。其中BP 相關條目20 個，包括化學突觸傳遞、神經遞質水平調節等；CC 相關條目6 個，表現在突觸前膜、膜面等；MF 相關條目11 個，其有受體配體活性、G 蛋白偶聯受體結合等。見圖7。

圖7 關鍵靶點GO 富集分析

KEGG 分析得到12 條信號通路，包括神經活性配體-受體相互作用、cAMP 信號通路等，并計算各信號通路富集因子，繪制氣泡圖。見圖8（封三）。

3 討論

3.1 用藥規律

藥物類別主要為平肝熄風藥和補虛藥，二者使用頻次占總頻次的51.01%，其次為清熱藥、安神藥、解表藥、化痰藥等。小兒肝常有余脾常虛，若稟賦素弱，或思慮緊張，致脾虛氣弱，失于運化，痰濁內生，阻于心竅，致脾氣乖戾，喉發異聲；或郁久化熱，上擾心神，則抽動呼叫，穢語時出；或見風痰鼓動，流竄經絡，則四肢抽動?！杜R證指南醫案》載“肝為風臟，因精血衰耗，水不涵木，木少滋榮，故肝陽偏亢，內風時起而現風癥”。因此臨床多表現為肝脾腎虧虛，風火痰瘀膠結成積。用解表藥之意在于宣肺、疏肝和發散外邪：宣肺之法，可使清氣升，濁氣降，利于肝氣疏泄；肝木不達則氣滯，借助疏肝以條達氣機；《西醫書屋夜話錄》載“凡人必先有內風而后外風，亦有外風引動內風者”，用解表藥以熄外風而平內風，令風靜動止。聚類和關聯分析顯示：半夏、陳皮、茯苓合用，有《太平惠民和劑局方》中二陳湯之意，可燥濕化痰，理氣和中。龍骨、牡蠣皆可平肝熄風，重鎮安神?！侗静萸笳妗吩唬骸褒埞枪εc牡蠣相同，但牡蠣咸澀入腎，有軟堅化痰清熱之功，此屬甘澀入肝，有收斂止脫鎮驚安魄之妙?！便^藤味甘微寒、入心肝經，善清心包之火，泄肝經之熱而熄風定驚止抽；白蒺藜苦泄辛散，疏肝平肝；全蝎味辛而甘，功專祛風。諸藥合用，則肝熱可清，肝風可祛。羚羊角、生地、防風、甘草為羚角鉤藤湯的主要組成，具有涼肝熄風，增液舒筋的功效。天麻、鉤藤、白芍、茯苓、石菖蒲、甘草是治療抽動障礙用藥的關鍵。其中天麻與鉤藤，皆可平肝熄風；白芍伍甘草即芍藥甘草湯，酸可收，甘可緩，共奏柔肝緩急之效；茯苓、石菖蒲清熱化痰。與抽動障礙肝亢風動、陰虛風動、痰熱動風的病機特點相一致。

3.2 作用機制

神經遞質紊亂及相應信號通路受損是TD 發生的重要原因，目前已證實的有多巴胺、去甲腎上腺素、5-羥色胺及氨基酸類神經遞質[11-14]。PPI 網絡拓撲分析得到AKT1、FOS、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGFA）等10 個核心靶點。其中AKT1 是磷酸肌醇被募集到質膜而激活的一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細胞存活和凋亡中起重要作用[15]。在中樞神經，IL-6 可通過激活JAK/STAT3、PI3K/AKT 等信號通路，抑制N-甲基-D-天冬氨酸受體激活介導的Ca2+內流，減輕鈣超載所導致的興奮性神經毒性損傷。此外，IL-6 可活化反應性星形膠質細胞，增加粘連蛋白表達，調控神經軸突損傷再生[16-17]。在神經興奮毒性或氧化應激條件下，VEGFA 能增加海馬神經元、小腦顆粒細胞和多巴胺能神經元的存活[18]。FOS 參與多種神經元活動，其陽性神經元的數量與所受神經刺激強度成正比[19]。以靶蛋白為媒介，核心藥物有效成分與相關通路存在密切聯系，基于此發揮治療作用。神經活性配體受體相互作用信號通路是質膜上所有與細胞內外信號通路相關的受體和配體的集合[20]。其中A 類生物胺受體基因Chrm3 表達上調可增強膽堿能功能，提高學習和記憶能力[21]。TD 患兒存在多巴胺系統的過度活躍或相關受體超敏感[22]，其中多巴胺D1 類受體正性調控環磷酸腺苷水平，通過激活蛋白激酶A 而調控細胞代謝，使跨膜G 蛋白偶聯受體去敏感化，導致細胞神經遞質釋放[23]。正常情況下，中樞神經元突觸前膜上的轉運體可通過調節神經遞質的釋放和再攝取，核心藥物可通過影響單胺跨膜轉運蛋白活性，調節神經遞質含量和作用時間。作為中樞神經系統與外周免疫系統相互作用的信使，血清中大量細胞因子聚集會造成神經基底節損傷[24-25]，導致皮質-紋狀體-丘腦-皮質環路的功能異常，引發一系列不自主的運動行為障礙[26]，核心藥物可影響細胞因子通路上的11 個靶點。

綜上，中醫藥治療抽動障礙以平肝熄風藥、補虛藥為主，立足于補肝脾腎之虛，兼顧心肺。作用機制方面，核心藥物可通過AKT1、IL-6、VEGFA 等核心靶點，調節化學突觸傳遞、神經遞質水平等生物過程，影響神經活性配體受體相互作用、cAMP 信號通路等治療通路，多成分、多靶點、多通路治療抽動障礙。本研究通過數據挖掘分析已公開的抽動障礙專利復方用藥規律，并結合網絡藥理闡釋其核心藥物作用靶點及通路，結果較為可靠，將通過試驗進一步的驗證。