元素分析-同位素質譜法測定黃芪中碳、氮同位素比值及其在產地溯源中的應用

明荔莉 范稚莉 王海燕 畢彬彬 唐梓意 李婉瑩

（拱北海關技術中心,廣東 珠海519000）

黃芪作為一味珍貴的中藥材,其藥用范圍廣泛,具有補中益氣、健脾益肺、托毒生肌之功效[1]。近年來,黃芪在醫(yī)藥、保健、養(yǎng)生領域的藥用價值受到人們的重視,具有廣闊的開發(fā)前景。我國黃芪的產地主要集中在山西大同、內蒙包頭、東北野生芪、甘肅隴西、山東萊陽、乳山等地[2]。不同產地的黃芪,其水土、氣候、日照、生物分布等生態(tài)因子差異很大,因而黃芪的生長特性具有一定的地域特征,其物理化學特點、產量和銷售價格有所不同,其藥效和品質也具有明顯的地域差異[3]。長期的臨床醫(yī)療實踐表明,要保證中藥材的品質,須強調地道藥材開發(fā)和應用,這對于保證中藥療效,起著十分重要的作用[4]。

常用的中藥材產地溯源技術有分子生物學[5,6]、指紋圖譜[7]、同位素示蹤[8]、無線射頻識別技術[9]和條形碼技術[10]。已有的研究表明,利用穩(wěn)定同位素指標進行產地溯源相比其他方法,具有分析速度快、精度高、準確性好的優(yōu)勢[11]。同位素溯源技術的基本原理與依據(jù)是穩(wěn)定同位素的自然分餾效應,由于不同產區(qū)的大氣、土壤、水等環(huán)境中含有生源要素同位素組成具有差異,加之生物體內的同位素組成受氣候、環(huán)境和生物代謝類型等因素的影響,不同地域來源的中藥材中同位素自然豐度存在差異[12]。因此,利用這種差異可以區(qū)分黃芪其可能的來源地區(qū)。

本項目利用穩(wěn)定同位素技術,建立元素分析-穩(wěn)定同位素質譜法（EA-IRMS）,測定不同產地黃芪樣品中碳、氮穩(wěn)定同位素比值（δ13C,δ15N）,通過統(tǒng)計分析,探討此方法在黃芪產地溯源中的應用。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

DELTA V ADVANTAGE 同位素質譜儀（美國Thermo Fisher 公司）,配備Flash 2000 HT 元素分析儀,ConFlo IV 萬用接口。氦氣（純度99．999%,載氣）、氧氣（純度99．999%,助燃氣）、二氧化碳（純度99．99%,參考氣）、氮氣（純度99．99%,參考氣）。8 mm×5 mm 錫杯；Milli-Q 超純水制備系統(tǒng)。尿素同位素標準物質IVA 33802174,咖啡因同位素標準物質IAEA-600。

1．2 樣品制備

來自4 個不同產地—山西大同、陜西子洲、甘肅隴西和內蒙,共24 個黃芪樣品。樣品經高速粉碎機磨碎、過篩后,保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 儀器條件

1．3．1 元素分析儀條件

燃燒管溫度（C、N 模式）:氧化還原爐溫度為980 ℃,GC 柱溫50 ℃,進樣器氦氣載氣流速為110 mL/min,氧氣流速為175 mL/min,吹掃氣流速為200 mL/min。

1．3．2 ConFlo IV 條件

氦氣壓力為0．6 bar,CO2參考氣壓力為1．0 bar,N2參考氣壓力為1．0 bar。

1．3．3 質譜條件

離子源電壓,2．9 KV；轟擊電壓,120．8eV；真空度,1．6 ×10-6mbar（針閥打開狀態(tài)下）。

1．4 碳、氮同位素測定

稱取約200 μg 粉末樣品,用錫杯包好后,經氧化還原爐高溫氧化還原和GC 柱分離,樣品中的碳、氮元素轉化為純凈的CO2和N2氣體,再經過ConFlo IV萬用接口對樣品進行適當?shù)南♂?進入質譜儀檢測。由于黃芪中碳、氮含量差異較大,通過調節(jié)樣品稀釋比,分別對碳、氮同位素比值進行測定。

1．5 精度和準確性測定

測定前,用已知δ13C 和δ15N 值的尿素和咖啡因標準物質對CO2和N2參考氣進行標定。樣品的測定精度用尿素同位素標準物質來控制,每測定6個樣品測定一個質控樣品,質控樣品的重復分析標準偏差小于0．3‰。每個黃芪樣品重復測定3 次,計算標準偏差,考察方法測定實際樣品的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性。

1．6 數(shù)據(jù)處理

采用Thermo electronisodat version 3．0 軟件計算同位素值和獲取數(shù)據(jù)。采用SPSS19．0（美國,IBM）進行統(tǒng)計分析,采用Origin 9．0 繪圖軟件（美國Originlab 公司）進行數(shù)據(jù)圖繪制。

2 結果與討論

2．1 穩(wěn)定性

樣品分析前,運行CO2、N2標準參考氣體進行onoff 測試,直至連續(xù)10 組參考氣體脈沖的δ13C、δ15N值的標準偏差（SD）分別小于0．06‰和0．3‰,才能進行樣品測試。為了測試本方法對實際樣品分析的穩(wěn)定性,對每個黃芪樣品分別進行3 次重復性分析,結果表明（見表1）,樣品δ13C、δ15N 值的SD 值均小于0．3‰,均在儀器分析允許誤差（0．3‰）范圍內,滿足穩(wěn)定性要求。

表1 不同產地黃芪樣品中δ13C、δ15N 值Tab．1 δ13C and δ15N values in Astragali Radix_among different regions

2．2 精度和準確度

樣品的測定精度和準確度,用實驗室質控樣品來控制。重復10 次測定已知δ13C、δ15N 值的質控標準物質,10 個質控樣品δ13C、δ15N 值的SD 分別為0．053‰、0．115‰,表明EA-IRMS 法的精度能到達要求。

2．3 碳、氮穩(wěn)定同位素比值

不同產地黃芪中δ13C 和δ15N 值箱線圖結果見圖1。山西大同不同種植基地黃芪的δ13C 值接近,波動范圍在-26．770‰～-25．007‰之間；陜西子洲黃芪的δ13C 值波動范圍小,在-26．391‰～-26．039‰之間；內蒙黃芪的δ13C 值范圍為-26．245‰～-25．092‰；甘肅隴西黃芪的δ13C 值范圍為-24．422‰～-22．780‰,相對其它產區(qū)其δ13C 值明顯偏負。

圖1 不同產地黃芪的δ13C、δ15N 值的箱線圖Fig．1 The boxplots of δ13C and δ15N values in Astragali Radix among different regions

山西大同不同種植基地黃芪的δ15N 值接近,波動范圍在-0．667‰～0．145‰之間；陜西子洲黃芪的δ15N 值波動范圍小,在-0．671‰～-0．263‰之間；甘肅隴西黃芪的δ15N 值范圍為-2．440‰～-0．187‰；內蒙黃芪的δ15N 值范圍為-2．107‰ ～1．156‰。δ15N值是土壤氮來源、土地利用方式、耕作措施等的指示,同一地區(qū)不同樣品間變異較大[13]。甘肅隴西和內蒙產地的黃芪樣品δ15N 值范圍波動較大,說明該地區(qū)在種植黃芪的土壤氮來源、土地利用方式或耕作措施上可能存在較大的地區(qū)性差異。

2．4 產地溯源分析

黃芪碳、氮穩(wěn)定同位素比值分析表明（見圖2）,甘肅隴西黃芪與其它3 個產地的δ13C 值均存在顯著性差異（p ＜0．002）,山西大同、陜西子洲和內蒙產地黃芪的δ13C 值無顯著差異,但各產地黃芪的δ15N 值無顯著性差異。研究表明,δ13C 值的差異是產區(qū)溫度、有效水含量等環(huán)境因子的綜合反映,部分地區(qū)間差異不顯著[13]。甘肅隴西與其它產地黃芪中δ13C 值存在顯著差異,體現(xiàn)了甘肅隴西黃芪生長環(huán)境與其它產區(qū)存在明顯差異。甘肅隴西地區(qū)四季分明,日照充足,氣候溫和,年平均氣溫6．2 ℃,平均降水量445 mm,黃芪生長氣候高寒陰濕,土地肥沃疏松,具有黃芪生長獨特優(yōu)越的地理條件。利用穩(wěn)定碳同位素比值,甘肅隴西黃芪能夠有效地區(qū)分與其它產地,說明穩(wěn)定碳同位素可應用于黃芪的產地溯源。

圖2 不同產地黃芪的δ13C 和δ15N 值Fig．2 δ13C and δ15N values in Astragali Radix among different regions

3 結論

EA-IRMS 法能夠快速測定黃芪中碳、氮穩(wěn)定同位素比值,測試結果準確可靠,準確度和精度均滿足要求。對山西大同、陜西子洲、甘肅隴西和內蒙4 個不同產地的黃芪樣品的分析表明,利用穩(wěn)定碳同位素比值能將甘肅隴西黃芪與其它產地有效區(qū)分,說明穩(wěn)定碳同位素技術可應用于黃芪的產地溯源。