基于TCGA 數據庫轉移性黑色素瘤lncRNA 生物信息學分析

于釗江

（安陽師范學院，河南 安陽 455000）

黑色素瘤是黑色素細胞異常增生引發的惡性腫瘤, 每年全世界有超過28 萬新發患者,6 萬多死亡病例[1]。黑色素瘤具有高度侵襲性,易廣泛轉移到淋巴系統和其他重要器官,近1/3 的患者最終發展為轉移性疾病[2]。然而,黑色素瘤的生長和轉移機制仍不清楚,需要進一步的研究。

LncRNA 是一類無蛋白質編碼潛能的生物大分子[3]。研究表明,lncRNA 廣泛參與腫瘤細胞生長、分化、凋亡、侵襲和轉移等[4],進而促進或抑制腫瘤的進展。因此,闡明lncRNA 在黑色素瘤中的功能有望為病人的診斷、預后判定和靶向治療奠定基礎。本研究從TCGA 數據庫中篩選所需數據, 篩選轉移性黑色素瘤相關lncRNA 及mRNA 基因,進行生物信息學分析,旨在為轉移性惡性黑色素瘤的深入研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 數據采集

從TCGA 數據庫中下載471 例黑色素瘤樣本RNA-seq 和miRNA-seq 數據。將下載數據生成基因表達矩陣文件,分為原位黑色素瘤組(103 例)和轉移性黑色素瘤組(368 例)。

1.2 差異表達mRNA、miRNA、lncRNA 數據分析

基于R 包edgeR 進行差異分析, 得到差異表達的mRNA、miRNA、lncRNA 數據。其中,利用GENCODE 的gtf基因注釋文件定義RNAseq 中的lncRNA 基因, 利用R 提取lncRNA,生成表達矩陣。

1.3 ceRNA 調控網構建

miRcode 數據庫預測lncRNA 與miRNA 的相互作用。利用Targetscan、miRBD、miRwalk 數據庫檢索miRNA 的靶向mRNA。調控網絡結果用Cytoscape3.8.1 軟件生成。

1.4 差異表達miRNA 靶基因功能注釋、通路分析

采用線上分析工具DAVID 與KOBAS 對lncRNA 靶向mRNA 進行基因本體論數據庫(GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書數據庫(KEGG)通路富集分析。

2 結果

2.1 差異表達lncRNA

根據log2FoldChange≥2 和P<0.01 的標準過濾數據,利用R對原位和轉移性黑色素瘤樣本進行分類比較,共篩選出39 個差異表達lncRNA,上調8 個,下調31 個(見圖1a);31 個差異表達miRNA,上調13 個,下調18 個(見圖1b);469 個差異表達mRNA,上調279 個,下調190 個(見圖1c)。

2.2 ceRNA 調控網絡構建

基于線上平臺構建的ceRNA 調控網絡, 進一步闡明差異表達的lncRNA 的作用。利用miRcode 數據庫搜索差異表達的lncRNA 的靶向miRNA, 結果顯示MIR250HG,SOX21-AS1,WT1-AS,OSTN-AS1,MDS2 有明顯的lncRNA-miRNA 相互關系,獲得的160 個靶向miRNA 與TCGA 數據庫獲得的差異miRNA進行比對, 篩選出7 個差異靶向miRNA, 分別是hsa-miR-150,hsa-miR-205,hsa-miR-129-5p,hsa-miR-141,hsa-miR-203,hsamiR-217,hsa-miR-26。利用Targetscan、miRBD、miRwalk 數據庫搜索miRNA 的靶向mRNA,取交集獲得靶向mRNA,再與TCGA數據庫獲得的差異mRNA 進行比對, 最終獲得被差異表達的miRNA 所靶向的50 個mRNA, 其ceRNA 網絡使用Cytoscape3.8.1 軟件構建,如圖2 所示。

2.3 差異表達的mRNA 功能注釋及通路分析

通過DAVID 與KOBAS 在線分析軟件對ceRNA 調控網中miRNA 靶向的50 個差異mRNA 進行GO 分析和KEGG 通路分析。GO 分析發現,生物學過程主要集中在生物調控,多細胞過程,刺激反應過程,細胞組分在細胞膜區域富集,分子功能集中在蛋白質結合,離子結合,核酸結合(見圖3)。KEGG 通路分析發現其主要集中在Salivary secretion,cAMP signaling pathway 等通路(見表1)。

圖3 ceRNA 調控網絡中差異mRNA 的GO 分析

3 討論

人類癌癥轉錄組的全基因組已經表明,lncRNA 表達是癌癥中最普遍的轉錄變化之一[5]。LncRNA 可通過組蛋白修飾、NDA 甲基化、轉錄因子活性調控、剪切調控[6]等多種途徑來參與腫瘤的發生、侵襲和轉移[7]。本文通過挖掘TCGA 數據庫,得到MIR205HG、SOX21-AS1、WT1-AS、OSTN-AS1、MDS2 五lncRNA。研究顯示SOX21-AS1 的異常表達可促進肺腺癌和乳腺癌的增殖、侵襲、遷移[8];過表達WT1-AS 可抑制細胞增殖,減少細胞遷移和侵襲[9];OSTN-AS1 是一種新的基于ceRNA 網絡的三陰性乳腺癌免疫相關預后標志物[10];受體樣激酶MDS2 促進SUMM2 介導的免疫[11]。

ceRNA 調控網失調可以引起癌癥的發生、發展、侵襲和轉移。通過ceRNA 調控網、GO、KEGG 分析發現lncRNA 與miRNA相互作用,進而調控差異mRNA 的表達,對信號通路產生影響,最終影響黑色素瘤的發生,轉移及遷徙。