蘇云金芽孢桿菌毒素殺滅譜：從昆蟲到人類癌細胞

張琳琳,杜忠華

(夏津一中，山東 德州 254300)

1 引言

蘇云金桿菌是一種革蘭氏陽性且產孢的細菌，廣泛分布于世界各地的土壤、植物和昆蟲中[1]。Bt之所以廣為人知，是因為它能產生多種用于農業害蟲防治的毒性蛋白(Cry、Vip、Sip)[2]，抑制蚊蟲傳播疾病(Cyt)[2]，并且對人類癌細胞具有毒性(PS、SLP和Cry)[3]。Bt的主要特征之一是在芽孢形成過程中，在芽孢旁邊產生具有立方形、雙錐狀、球形、橢圓形或不規則形狀伴胞晶體，它們是由δ-內毒素單體聚集而成，根據它們的序列相似性可分為Cry和Cyt毒素。此外，Bt在其生命周期種還可以產生其他重要的毒素，如副孢毒素、表層蛋白、Vip和Sip蛋白。目前，Bt毒素已被分離并分類為至少78個Cry、3個Cyt、6個副孢毒素蛋白、1個SLP、1個Sip和4個Vip蛋白家族。這些都將在本文進行闡述。

2 Bt內毒素

2.1 Cry毒素

Cry蛋白因其對膜翅目、鞘翅目、同翅目、直翅目等昆蟲以及線蟲、螨類和原生動物等具有毒性而廣為人知[2]。它主要以傳統的殺蟲制劑或轉基因作物形式應用于害蟲的生物防治。

Cry毒素主要是在Bt芽孢形成過程中產生，根據其序列同源性提出了一個四級分類系統。序列同源性小于45%的Cry毒素在初級水平上不同，如Cry1、Cry2等。序列同源性大于78%的Cry毒素被進一步分為二級，名稱加上大寫字母，如Cry1A、Cry1B。95%同源性的毒素構成第三級的邊界并用小寫字母區分這些蛋白質，如Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac。

Cry蛋白的晶體結構顯示其含有3個結構域，因此，Cry毒素也被稱為3d-Cry毒素。結構域I主要與毒素的寡聚化和在細胞膜上形成穿孔有關。結構域Ⅱ與毒素的特異性有關，參與和受體的結合。結構域Ⅲ與受體特異性結合和細胞膜上的孔隙形成有關[2]。3d-Cry蛋白可由分子量約130 kDa的長原毒素產生，如Cry1Aa蛋白；或分子量為65～70 kDa短原蛋白產生，如Cry11Aa蛋白[4]。長原毒素在C端和N端由昆蟲中腸蛋白酶處理加工，而短的原毒素只在N端進行加工，產生分子量約為60～70 kDa的核心活性區域，保留了3d結構，該片段對昆蟲幼蟲、線蟲、原生動物和人類癌細胞具有細胞毒性[4]。

穿孔機制模型是被普遍接受的Cry毒素的作用機制模型[5]，另外還有信號通路模型等殺蟲機制的提出[5]。

2.2 Cyt家族

Cyt毒素的大小從25～28 kDa不等；它們的三維結構顯示Cyt蛋白是一個單一的α-β結構域，與Cry毒素序列同源性較低[6]。Cyt毒素主要對作為人類疾病媒介的蚊子有活性；如按蚊屬(瘧疾)、伊蚊屬(登革、寨卡和基孔肯雅)和庫蚊屬(尼羅河熱和裂谷熱)[6]。Bt以色列亞種(Bti)由于可以產生Cry4Aa、Cry4Ba、Cry10Aa、Cry11Aa、Cyt1Aa、Cyt2Ba和Cyt1Ca毒素，被常用來控制這些媒介生物[6]。到目前為止，主要鑒定了3個Cyt毒素亞家族，它們都具有很高的序列同源性：Cyt1(1Aa，1Ab，1Ab，1Ac和1Ad)，Cyt2(2Aa，2Ba，2Bb，2Bc，2Ca)和Cyt3Aa1。

Cyt毒素還與不同家族成員之間具有協同作用。當Cyt1Ab和Cyt2Ba共同作用時，它們增強了對埃及伊蚊幼蟲和致倦庫蚊幼蟲的殺蟲活性。Cyt1Aa的兩個已知表位(196EIKVSAVKE204和220NIQSLKFAQ 228)與Cry4B和Cry11Aa毒素結合，增強其對白按蚊和致倦庫蚊的毒性作用[7]。當Cyt1Aa與膜細胞受體結合時，Cry11Aa或Cry4B與這種毒素結合，增加寡聚和孔形成效應[7]。

2.3 副孢蛋白

副孢蛋白與Cry毒素的氨基酸序列同源性低于25%。然而，它們的作用機制非常相似，這兩個家族都能識別癌細胞上的特定膜受體，從而觸發細胞死亡[8]。副孢蛋白不誘導溶血活性，但可能具有殺蟲活性，它們在體外對人類癌細胞而不是健康人體細胞表現出優先的細胞毒性。

廣泛地篩選分析發現了Bt菌株可能的新靶點，表明非殺蟲Cry蛋白比殺蟲Cry蛋白在自然界中分布更廣泛。這也促使研究人員對非殺蟲和非溶血性Cry蛋白可能的生物活性或靶點進行了研究。Mizuki等在1999年對1744株Bt菌株的蛋白酶消化的伴胞蛋白進行大規模篩選分析后，首次報道了Bt的δ內毒素對白血病細胞具有選擇性細胞毒性。這也引發了后續對癌細胞具有細胞毒性的非殺蟲和非溶血性毒素的廣泛篩選，從而導致了一種新型的Cry蛋白的分類，稱為副孢蛋白(PS)[9]。首先，這個新分類包括所有非殺蟲和非溶血性Cry毒素，它們對癌細胞具有選擇性細胞毒性[9]。一段時間后，人們認為非溶血性但有殺蟲活性的蛋白也可能是這一分類的一部分[9]。到目前為止，共鑒定出19種副孢蛋白，并分為6個家族[9]，并且副孢毒素對癌細胞的作用機制尚不清楚。

2.4 SLP蛋白

表面層蛋白(SLP)在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中都有廣泛的存在，包括芽孢桿菌。表面層蛋白(SLP)可嵌入許多革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的細胞膜中；它們通常與多糖和肽聚糖結合。SLP蛋白的主要功能是：與細胞外蛋白相互作用；抵御病原體；吞噬作用；膜穩定；粘附等[10]。與cry基因不同，cry基因是在孢子形成過程中表達的，SLP在整個細胞生命周期中都有組成性表達。SLP毒素活性尚不清楚，有人認為SLP與Cry蛋白具有相似的殺蟲活性，但機制不同[11]。最近的一項研究報道了Bt的SLP對MDA-MB-231乳腺癌細胞株具有高選擇性細胞毒活性，作者認為癌細胞中存在的鈣粘蛋白-11受體似乎參與了與SLP的識別，但其作用機制仍在研究中[3]。

3 Bt分泌的毒素

除了孢子形成期間產生的Cry、Cyt、PS和SLP毒素外，Bt還可以在營養生長期分泌其他具有殺蟲活性的毒素。主要有兩個家族，一個是營養型殺蟲蛋白(Vip)[12]，另一個是分泌型殺蟲蛋白(Sip)[13]。

3.1 Vip毒素

Vip毒素是Bt在其營養生長期產生并直接分泌到胞外的一類毒素，它的表達一般在Bt孢子形成期開始之前結束[12]。這類殺蟲毒素根據其序列同源性主要可分為四類：Vip1、Vip2、Vip3和Vip4。目前已報道的Vip蛋白有15種Vip1蛋白、20種Vip2蛋白、101種Vip3蛋白和1種Vip4，它們對昆蟲的作用機制尚不完全清楚。

Vip1原毒素約為100 kDa，分泌后會形成約80 kDa的成熟毒素，此外，Vip2會形成約50 kDa的成熟片段[12]。Vip1和Vip2是以二元毒素的形式發揮毒性，對一些鞘翅目和半翅目的害蟲具有協同殺蟲活性[12]。Vip2在結構和功能上與艱難梭菌的CdtA毒素相似；該毒素具有ADP核糖基轉移酶活性，其主要靶點是肌動蛋白，因此，當其被激活時，可能會導致細胞骨架破裂和細胞死亡[12]。在單體形式下，Vip1與其受體結合，從而促進Vip1毒素的多聚化，多聚化的Vip1進一步將Vip2轉運到細胞質中。一旦進入細胞，Vip2破壞肌動蛋白絲，破壞細胞骨架，最終導致細胞死亡[12]。

Vip3對多種鱗翅目昆蟲具有明顯的毒性。Vip3原毒素約為88kDa，與其他已知的殺蟲蛋白沒有同源性[12]。與Vip1和Vip2相比，Vip3中的信號肽序列在分泌過程中不被加工，而是存在于成熟的分泌肽中，這表明它們在蛋白質結構和殺蟲活性中起著重要作用。經蛋白酶處理之后, Vip3會被酶解成約66kDa和19KDa的激活狀態，兩個片段仍然結合在一起。Vip3以四聚體的方式存在，其作用機制尚不清楚。

Vip 4是最近發現的Vip家族成員，分子量約為108kDa，其研究較少[12]。

3.2 SIP毒素

分泌型殺蟲蛋白(Sip)是Bt所分泌產生的分子量約為41kDa毒素蛋白[13]。與Vip蛋白類似，Sip毒素N端包含一個由30個氨基酸組成的信號肽序列，通過蛋白酶處理后，會釋放出具有殺蟲活性蛋白片段[13]。研究顯示Sip蛋白對鞘翅目昆蟲具有殺蟲活性，如馬鈴薯甲蟲和玉米根蟲等[14]。但作用機制并不清楚。

4 結論

了解Bt毒素的結構特征及其作用機制，將有助于開發以改善害蟲防治和人類健康的新產品。在2019年，Mendoza等首次報道了來自Bt的Cry1A毒素在HeLa細胞中表現出高度特異性的抗癌活性，并且對昆蟲也有抑制作用。Cry毒素和細胞膜受體之間的特定相互作用可能引發對昆蟲和人類癌細胞的毒性[15]。

SLP蛋白是一種具有殺蟲和抗癌活性的Bt毒素[16]。最近的研究表明，這些蛋白質也可以識別癌細胞系中的特定細胞膜受體。除了對昆蟲和人類癌癥細胞株具有毒性活性外，SLP還在一些微生物中起到維持結構和保護功能。此外，這些蛋白質不僅存在于Bt中，在其他一些革蘭氏陽性、革蘭氏陰性和古細菌中也有發現。

副孢蛋白在體外也具有特異的抗癌活性；這些蛋白質存在于非殺蟲和非溶血菌株中，為開發具有治療潛力且對患者無副作用的抗癌藥物提供了可能性。然而，關于它們的作用機制和作用受體的研究較少。

當前，需要更多的研究來了解Bt毒素的作用機制。根據研究報道，它們中的大多數可能識別敏感細胞中的特定細胞膜受體；然而，一旦相互作用開始，細胞內發生了什么仍然是個謎。因此，研究和了解于Bt毒素發揮毒性有關的信號通路，對開發新的抗癌化合物，提高害蟲防治水平，改善Bt毒素的抗性等都至關重要。