LMP2A、YAP及P27蛋白在鼻咽癌中的表達及與臨床病理特征、預后的關系

王 瑩，蘭艷麗，蘭小嬌，趙 維

鼻咽癌(NPC)是指發(fā)生于鼻咽腔側壁、頂部的惡性腫瘤，在我國有極高的發(fā)生率[1]。NPC可影響患者聽覺、視覺，并損傷顱神經，引起涕中帶血、鼻塞、耳鳴、復視及頭痛等癥狀，嚴重影響患者生活質量，而腫瘤轉移可致患者死亡[2-5]。NPC發(fā)生發(fā)展的分子機制引起了學者們的廣泛關注[6]。在腫瘤細胞轉移及侵襲過程中，上皮間質轉化(EMT)起著重要的作用。相關文獻表明，外源性表達潛伏膜蛋白2A(LMP2A)在NPC細胞EMT和腫瘤干細胞自我增殖過程中起促進作用，然而其與NPC的關系鮮有報道[7]。Yes相關蛋白(YAP)是近年發(fā)現的一種原癌基因，在多種腫瘤中異常表達。此外，P27蛋白作為一種重要的抑癌基因，也是國外學者研究較多的一種預后因子[8]。本研究就LMP2A、YAP及P27蛋白在NPC中的表達及與臨床病理特征、預后的關系進行分析，旨在為臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年1月—2018年1月我院行手術治療的NPC 90例活檢術石蠟標本。納入標準：術前病理診斷為NPC或鼻咽黏膜慢性炎；患者行手術聯合放化療；臨床資料無缺失。排除標準：合并血液系統(tǒng)疾病者；存在除NPC以外其他原發(fā)性惡性腫瘤者；合并自身免疫性疾病者。最終81例納入作為NPC組。同時選取50例本院病理科保存的鼻咽黏膜慢性炎組織標本，排除臨床資料不完整、合并其他感染性疾病、合并自身免疫性疾病者，最終46例納入對照組。2組基線資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法 收集所有患者臨床資料，比較LMP2A、YAP及P27蛋白在2組中的表達情況；分析LMP2A、YAP及P27蛋白與NPC患者各病理參數間的關系；記錄NPC患者在隨訪時間內是否死亡，采用多因素Logistic回歸分析探討影響NPC患者預后生存的因素，繪制Kaplan-Meier生存曲線研究3項指標對患者預后的影響。

1.3觀察指標

1.3.1檢測方法：組織標本利用石蠟處理，切成厚5 μm薄片置于載玻片上，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，二甲苯脫蠟2次，每次10 min。PBS液漂洗3次，每次3 min，蘇木素染色2 min，置于顯微鏡下觀察并計算2組LMP2A、YAP及P27蛋白表達情況。已知陽性組織切片為陽性對照，已知陰性組織切片為陰性對照，PBS液代替一抗為空白對照。

1.3.2LMP2A、YAP及P27蛋白表達判定標準[9]：LMP2A陽性表達定位于胞膜和胞質，YAP、P27蛋白陽性表達定位于胞質和胞核。免疫組織化學染色評判標準：①按陽性細胞占細胞總數的百分比計分：<5%、5%～25%、25%～50%、50%～75%、≥75%分別計為0～4分；②染色強度評估：無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計為1～3分；③將①的分值乘以②的分值即為實驗結果：陰性(-)表達0分，弱陽性(+)表達1～4分，中度陽性(++)表達4～8分，強陽性(+++)表達8～12分，以(-)及(+)作為低表達，(++)及(+++)作為高表達。

1.4隨訪方法 自患者手術結束開始隨訪，共隨訪2年，截止時間為2020年1月31日或患者死亡。總生存時間為患者手術至死亡的時長[10]。

2 結果

2.12組LMP2A、YAP及P27蛋白表達情況 NPC組LMP2A、YAP高表達率、P27蛋白低表達率高于對照組(P<0.01)，見表1。

表1 鼻咽癌和鼻咽黏膜慢性炎患者LMP2A、YAP及P27蛋白表達比較[例(%)]

2.2相關蛋白與NPC患者病理參數的關系 組織高分化、淋巴結無轉移、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、無遠處轉移、非角化性未分化型的NPC患者LMP2A、YAP高表達率及P27蛋白低表達率較組織中低分化、有淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、遠處轉移、非角化性分化型NPC患者低(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 LMP2A、YAP及P27蛋白與NPC患者病理參數的關系(例)

2.381例NPC患者預后情況 截至隨訪結束，81例NPC生存54例，死亡27例，病死率為33.33%。

2.4影響NPC患者預后生存的多因素Logistic回歸分析 組織分化程度、病理分型、TNM分期、淋巴結轉移及LMP2A、YAP、P27蛋白表達情況為NPC患者預后生存的獨立危險因素(P<0.05，P<0.01)，見表3。

表3 影響NPC患者預后生存的多因素Logistic回歸分析

2.5LMP2A、YAP及P27蛋白對NPC患者預后生存的影響 LMP2A低表達組平均生存時間為(36.55±0.28)個月，高表達組平均生存時間為(31.55±0.22)個月，LMP2A低表達組平均生存時間長于高表達組(P<0.01)。YAP低表達組平均生存時間為(35.98±0.24)個月，高表達組平均生存時間為(31.13±0.24)個月，YAP低表達組平均生存時間長于高表達組(P<0.01)。P27蛋白低表達組平均生存時間為(33.02±0.27)個月，高表達組平均生存時間為(36.93±0.20)個月，P27蛋白高表達組平均生存時間長于低表達組(P<0.01)。見圖1。

圖1 LMP2A、YAP及P27蛋白對NPC患者預后生存的影響LMP2A為潛伏膜蛋白2A，YAP為Yes相關蛋白,NPC為鼻咽癌

3 討論

NPC在我國南方高發(fā)區(qū)位居頭頸部惡性腫瘤首位，居所有惡性腫瘤的第8位。因NPC病理類型以非角化型為主，對放療敏感，但易發(fā)生局部和遠處轉移[11]。近年，隨手術及放療技術發(fā)展，NPC生存率顯著提高，但近期生存率仍低于80%。本研究顯示，截至隨訪結束，81例NPC病死率為33.33%，說明NPC仍是威脅大眾健康的重要疾病[12]。

轉移是NPC患者預后不良的主要原因，目前認為NPC的病情進展、預后生存與EB病毒感染關系密切[13]。LMP2A是靜止B細胞中唯一可被檢查到的EB病毒潛伏感染基因[14]。研究表明，LMP2A在調控細胞一系列生理活動及維持腫瘤干細胞特性等方面均起重要作用，且還能參與Wnt/β-cate-nin、PI3K/Akt、MAPK、ERK和Hedge-hogn等多條信號通路的調控[15]。本研究顯示，LMP2A在NPC組織中高表達率顯著高于鼻咽黏膜慢性炎組織，說明LMP2A參與了NPC的惡性進展。

YAP是一種多功能的細胞內連接蛋白和轉錄共激活因子，為Hippo抑癌基因通路的主要效應子，在細胞正常生長發(fā)育過程中起重要作用[16]。通過YAP進行的Hippo信號傳導可調控干細胞和祖細胞的增殖活性。同時YAP作為一種有效的致癌基因，其表達水平異常會引起腫瘤發(fā)生[17]。據相關研究顯示，在大腸癌[18]等多種癌細胞中YAP均異常表達。生物學研究表明，過高的YAP表達在腫瘤細胞生長與增殖中均起一定促進作用，且其速度與YAP表達呈正相關[19]。本研究結果顯示，YAP在NPC組織中高表達率顯著高于鼻咽黏膜慢性炎組織，說明其對NPC的發(fā)生、發(fā)展及預后有重要影響。

NPC是一種高頻率基因CpG島甲基化腫瘤，腫瘤相關基因的甲基化改變參與了細胞周期調控、DNA修復、細胞凋亡及腫瘤浸潤轉移等過程。當P27蛋白表達降低或缺失時，可失去負性調控能力，使細胞周期正調控因子活性增強，引起細胞過度增殖甚至癌變[20]。有研究證明，P27蛋白在多種腫瘤中異常表達[21]。本研究采用免疫組織化學染色法鑒定P27蛋白在NPC組織中的表達特性，結果顯示，P27蛋白陽性表達定位于胞質及胞核中，與鼻咽黏膜慢性炎組織相比，其在NPC組織中呈顯著低表達，證明了P27蛋白在NPC發(fā)展過程中的調節(jié)作用。

本研究還顯示：LMP2A、YAP及P27蛋白與NPC患者組織分化程度、淋巴結轉移、TNM分期、遠處轉移及病理分型呈顯著相關性，且不同LMP2A、YAP及P27蛋白表達情況下Keplan-Meier生存曲線明顯不同，LMP2A、YAP低表達組平均生存時間長于高表達組，P27蛋白高表達組平均生存時間長于低表達組，進一步提示LMP2A、YAP及P27蛋白與NPC患者病情惡化程度關系密切，可作為臨床評估NPC患者預后的有效指標及潛在治療靶點。此外，組織分化程度、病理分型、TNM分期、淋巴結轉移及LMP2A、YAP、P27蛋白表達情況為NPC患者預后生存的獨立危險因素，提示在NPC患者治療中，應對伴有高危因素者進行針對性干預，以減緩患者病情進展、改善患者預后、延長患者生存時間。

綜上，LMP2A、YAP在NPC患者中表達升高，P27蛋白表達降低；LMP2A、YAP高表達及P27蛋白低表達與NPC發(fā)生、病情進展及預后有密切聯系，可作為預測NPC患者預后的分子標志物和潛在治療靶點。