右美托咪定對膿毒癥小鼠中樞神經炎癥反應的調控及機制研究

肖秀英

膿毒癥可誘發膿毒癥相關性腦病等嚴重并發癥，嚴重影響患者預后[1]。膿毒癥導致的中樞神經系統過度炎癥反應為患者長期神經功能認知障礙的發生機制，而小膠質細胞活化在其發生及演變過程中扮演著重要的角色[2-3]。外科手術引發的外周血炎性因子顯著升高，其進入中樞神經系統后可導致小膠質細胞異常激活，呈現M1狀態，進一步加劇炎癥反應[4]。研究證實，在全身炎癥反應發生及演變環節中，炎癥反應及中樞神經系統小膠質細胞活化后均可嚴重破壞血腦屏障正常功能[5]。右美托咪定(Dex)目前已被證實可降低術后患者神經認知功能障礙發生風險，顯著抑制炎癥反應,可能是其保護神經認知功能的主要機制[6]。本研究旨在探究Dex通過減輕膿毒癥小鼠外周血和大腦海馬區神經炎癥反應對神經認知功能恢復的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 51只6～8周CD1小鼠購于北京泰澤嘉業科技發展有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2020-0018。所有小鼠分籠飼養，每籠3只，并置于SPF級動物房中飼養，每12小時晝夜更替，并予充足食物及水，隔日更換墊料1次。

1.2主要試劑與儀器 Dex購于上海吉至生化科技有限公司；伊文氏藍(EB)購于ChemeGen中國；高遷移率族蛋白1(HMGB1)、晚期糖基化終末產物受體(RAGE)抗體購于武漢益普生物科技有限公司；小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)等試劑盒購于上海江萊生物科技有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1造模與分組：將51只CD1小鼠隨機分為假手術組、膿毒癥組、Dex組各17只。假手術組小鼠僅行開腹手術及盲腸暴露操作，余2組采用盲腸結扎及穿孔方式建立膿毒癥小鼠模型，具體方法：采用異氟烷麻醉小鼠并暴露腹部，剃毛后消毒，由劍突下緣沿腹中線做1 cm切口。分離盲腸并暴露，取4-0手術線于盲腸基底部與盲端連線中點結扎。后通過21 G注射器針頭于結扎處與盲端中點實施穿透式穿刺，同時于穿刺點通過無損傷鑷子擠出少量糞便。將小鼠盲腸回納入腹腔，并取6-0絲線縫合，關閉腹腔[7]。建模成功后，Dex組小鼠采用50 μg/kg Dex腹腔注射，建模成功后5 min首次注射，后每隔2 h注射1次，共3次。假手術組、膿毒癥組小鼠于相同時間采用6.25 ml/kg生理鹽水腹腔注射。

1.3.2巴恩斯迷宮(Barns Maze)測試：術后2周每組隨機抽取7只小鼠行Barns Maze測試，分析其空間學習記憶能力(進入目標盒時間)，時間設置為4 d，每日進行2輪，時間為3 min。

1.3.3條件恐懼實驗：Barns Maze測試結束后第2日各組隨機抽取7只小鼠行條件恐懼實驗，比較各組小鼠在環境及聲音條件下的僵直時間。

1.3.4血腦屏障通透性檢測：術后24 h每組取10只小鼠采用EB實施血腦屏障通透性檢測。異氟烷麻醉，斷頭處死小鼠分離腦組織，冰上快速分離雙側海馬組織，經蛋白裂解液裂解后于冰上研磨成組織勻漿，離心后取上清液待檢。采用BCA蛋白檢測試劑盒測定各組小鼠海馬組織蛋白濃度，Western blot法檢測HMGB1、RAGE蛋白表達水平。

1.3.5小膠質細胞活化程度：每組取10只小鼠檢測小鼠中樞神經系統大腦海馬區Iba-1表達水平。

1.3.6炎性因子檢測：術后24 h于各組10只小鼠右心室取血，離心后取血清采用ELISA法測定各組小鼠外周血及海馬組織TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

2 結果

2.1各組小鼠空間學習記憶能力比較 1、2、3、4 d時，膿毒癥組小鼠進入目標盒時間顯著長于假手術組(P<0.05)；Dex組小鼠進入目標盒時間顯著短于膿毒癥組(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠空間學習記憶能力比較

2.2各組小鼠條件恐懼實驗僵直時間比較 在環境及聲音條件恐懼實驗中，膿毒癥組小鼠僵直時間均顯著短于假手術組，Dex組小鼠僵直時間均顯著長于膿毒癥組(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠條件恐懼實驗僵直時間比較

2.3各組小鼠大腦海馬區EB含量及HMGB1、RAGE蛋白表達水平 假手術組、膿毒癥組和Dex組小鼠大腦海馬區EB含量分別為(49.96±9.98)、(72.96±15.99)及(56.99±11.23)μg/g，膿毒癥組小鼠大腦海馬區EB含量顯著高于假手術組，Dex組小鼠EB含量顯著低于膿毒癥組(P<0.05)。膿毒癥組小鼠大腦海馬區HMGB1、RAGE蛋白表達水平顯著高于假手術組，Dex組小鼠HMGB1、RAGE蛋白表達水平顯著低于膿毒癥組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠大腦海馬區HMGB1、RAGE蛋白表達水平Dex為右美托咪定，HMGB1為高遷移率族蛋白1，RAGE為晚期糖基化終末產物受體；與假手術組比較，aP<0.05；與膿毒癥組比較，bP<0.05

2.4各組小鼠大腦海馬區小膠質細胞活化程度比較 假手術組、膿毒癥組和Dex組小鼠大腦海馬區Iba-1表達水平分別為(1.76±0.20)、(6.08±0.35)和(2.49±0.11)μg/g。膿毒癥組小鼠大腦海馬區Iba-1表達水平顯著高于假手術組，Dex組小鼠Iba-1表達水平顯著低于膿毒癥組(P<0.05)。

2.5各組小鼠外周血及大腦海馬區TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 膿毒癥組小鼠外周血及大腦海馬區TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著高于假手術組(P<0.05)；Dex組小鼠外周血及大腦海馬區IL-6、IL-1β水平均顯著低于膿毒癥組(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠外周血及大腦海馬區TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較

3 討論

PRESCOTT和ANGUS[8]研究顯示，血腦屏障損傷在膿毒癥相關性腦病病理生理過程中扮演著重要角色，其通透性升高可導致大量炎性介質進入中樞神經系統，增強中樞神經系統炎癥反應[9]。小膠質細胞處于M1狀態時被公認為是中樞神經系統炎癥反應的“效應放大器”[10]。WANG等[11]研究顯示，小膠質細胞活化后可分泌HMGB1，并作為RAGE配體存在；HMGB1可激活血管內皮細胞中的RAGE蛋白，并進一步加劇血管內皮細胞氧化應激反應，最終導致血腦屏障破壞。

有學者分別采用丙泊酚及Dex對區域阻滯髖關節手術患者進行干預，結果發現經Dex干預患者較丙泊酚干預患者術后神經認知功能恢復佳[12]。KONG等[13]發現Dex可顯著減少脂多糖誘導的膿毒癥動物模型中樞神經系統炎癥反應，同時可抑制中樞神經系統小膠質細胞活化。MEI等[14]研究證實，Dex可顯著緩解外源性HMGB1誘發的神經認知功能障礙，有利于改善血腦屏障損傷。GAO等[15]研究顯示，Dex可阻斷激活后的小膠質細胞分泌炎性因子，且該功能可被α2腎上腺素受體阻斷劑逆轉，說明Dex可直接調控小膠質細胞功能。

本結果顯示，膿毒癥可誘發小鼠大腦海馬區神經炎癥反應，并導致血腦屏障通透性升高，外周血及大腦海馬區TNF-α、IL-6、IL-1β水平和中樞神經系統小膠質細胞活化程度升高，除此之外，大腦海馬區HMGB1、RAGE蛋白表達水平亦顯著增加，加重了神經功能障礙。XING等[16]研究顯示，中樞神經系統炎癥可誘發學習記憶能力障礙。QIU等[17]報道表明，采用剖腹探查術及異氟烷麻醉可加劇中樞神經系統炎癥反應，進而導致小鼠神經認知功能障礙。而本實驗發現Dex經腹腔注射后不僅可明顯緩解膿毒癥小鼠外周炎癥反應，還可改善小鼠大腦海馬區炎癥反應，此時大腦海馬區小膠質細胞活化程度及HMGB1、RAGE蛋白表達水平隨之降低。除此之外，我們還發現Dex可改善膿毒癥誘發的血腦屏障損傷，有利于促進小鼠神經認知功能恢復。

綜上，Dex可改善膿毒癥小鼠外周和大腦海馬區神經炎癥反應，減輕膿毒癥導致的血腦屏障通透性升高程度，有利于促進神經認知功能的恢復。