口含煙中致病菌雙重實(shí)時熒光PCR檢測法的建立

傅婧 佘娟 董睿

目的：建立口含煙中腸道沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的雙重?zé)晒釶CR檢測法。方法：在NCBI中檢索腸道沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的毒素基因序列，設(shè)計(jì)引物和探針;對收集到的腸道沙門氏菌、金黃色葡萄球菌各10株菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測，檢查方法特異性;制作陽性質(zhì)粒稀釋梯度，探索方法檢出限;調(diào)取30批次實(shí)際樣品，驗(yàn)證方法實(shí)用性。結(jié)果：建立的雙重?zé)晒釶CR法可準(zhǔn)確檢測腸道沙門氏菌sseL基因、金黃色葡萄球菌Coa基因，檢出限低至10 copies/μL;在實(shí)際樣品的方法比對中與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法結(jié)果相同。結(jié)論：雙重?zé)晒釶CR法可有效縮短口含煙中腸道沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的檢測時間并減少實(shí)驗(yàn)操作，具有一定實(shí)用價值。

口用型無煙氣煙草制品通俗稱為口含煙，主要分類有膠基煙、袋裝口含煙、含化煙等，在歐美國家占有一定市場份額，近年來在我國的市場占有率也快速增長。在產(chǎn)品分類上，口含煙屬于食品，安全指標(biāo)包括感官、物理、化學(xué)、微生物等多項(xiàng)檢測。其中，微生物指標(biāo)包括菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌、致病菌檢測。

Sa. enterica、St. aureus的基因檢測研究較為深入，通常選擇16S rRNA序列或毒素基因作為靶標(biāo)。16S rRNA是目前最常用的細(xì)菌系統(tǒng)分類分子鐘，但一些報道稱在致病菌檢測上存在一定誤檢率;另一方面，隨著對致病菌毒性機(jī)理的深入研究，已有若干毒素基因可供篩選檢測，特異性更強(qiáng)。本研究設(shè)計(jì)了毒素基因的引物和探針，在收集到的Sa. enterica、St. aureus菌株上進(jìn)行驗(yàn)證，從而建立口含煙中Sa. enterica、St. aureus雙重實(shí)時熒光PCR檢測法。

1 材料

1.1 菌種來源：從ATCC、CMCC、CTCC等菌種庫購買，從本地醫(yī)院、疾控中心、質(zhì)檢院等單位獲贈各10株腸道沙門氏菌、金黃色葡萄球菌。

1.2 標(biāo)靶基因：檢索NCBI的Genbank后獲得腸道沙門氏菌sseL（Salmonella secreted factor L）基因和金黃色葡萄球菌Coa（Staphylocoagulase）基因序列50條以上，首先用Lasergene v11.2.1中的MegAlign軟件比對出保守序列，使用Oligo v7.60設(shè)計(jì)引物和探針，再用NCBI的Primer-Blast驗(yàn)算篩選，最后進(jìn)行實(shí)踐驗(yàn)證。

2方法

2.1 DNA提?。核蠸a. enterica菌株用BPW培養(yǎng)基、St. aureus菌株用7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基在36 °C增菌18 h，取100 μL用QIAamp DNA Mini Kit提取DNA作為驗(yàn)證材料。

2.2 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線：特選Sa. enterica菌株CMCC（B）50071、St. aureus菌株ATCC6538的DNA提取液，用表1所述引物擴(kuò)增目的基因，切膠回收后接入pMV-20T載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E. coli細(xì)胞JM109，提取質(zhì)粒并稀釋至106 copies/μL，最后再將2種質(zhì)粒稀釋混制成105 copies/μL的陽性質(zhì)粒標(biāo)液，再用超純水按10倍逐級稀釋，形成105、104、103、102、10 copies/μL濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 陰性及空白對照組：陰性對照組包括志賀氏菌（CICC21535）、溶血性鏈球菌（CICC10373）、副溶血性弧菌（CICC21617）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（CICC21633）、大腸桿菌O157

3 結(jié)果

3.1 驗(yàn)證結(jié)果

陰性對照組（NC）和空白對照（BC）無FAM、VIC熒光對數(shù)增長，Ct值 ≥ 40.0。用于驗(yàn)證的10株Sa. enterica菌株在FAM/sseL、10株St. aureus菌株在VIC/Coa熒光信號上均有對數(shù)增長，且15.0 ≤ Ct值 ≤ 35.0。此外，所用的St. aureus基因組與Sa. enterica基因組也互為陰性對照，分別在FAM、VIC信號上無熒光對數(shù)增長，Ct值 ≥ 40.0。

S. e.：10株Sa. enterica菌株熒光曲線，S. a.：10株St. aureus菌株熒光曲線，NC：5株陰性對照株曲線，BC：空白對照超純水曲線。

3.2 定量檢測

FAM/sseL、VIC/Coa標(biāo)準(zhǔn)梯度的熒光信號均有對數(shù)增長，F(xiàn)AM/sseL標(biāo)曲Slope -3.46、R2> 0.99，VIC/Coa標(biāo)曲Slope -3.57、R2> 0.99。30批次實(shí)際樣品中，1批次含化煙檢出Sa. enterica、1批次口含煙檢出St. aureus。用設(shè)備自有的熒光PCR儀軟件計(jì)算出樣品中sseL和Coa拷貝數(shù)分別為27.46copies/μL、3.24×102 copies/μL。上述30批次樣品使用GB 4789.4-2016、GB 4789.10-2016進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)，同批次檢出Sa. enterica陽性、St. aureus陽性，其余為陰性，與定量檢測的定性結(jié)果一致。

4 討論

經(jīng)上述驗(yàn)證，本文設(shè)計(jì)的引物和探針組對本研究收集的小樣本菌株以及實(shí)際樣品的Sa. enterica、St. aureus能夠有效檢出，檢出限≥10 copies/μL，與文獻(xiàn)報道的處于同一量級[]。相比傳統(tǒng)方法的反復(fù)增菌篩選過程，PCR技術(shù)具有快速簡便的優(yōu)勢，實(shí)時熒光PCR技術(shù)更具有原位定量的特性，能夠還原解析樣品自身狀態(tài)。

在定量限方面，可見標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10 copies/μL濃度的Ct值已接近35，較為合適。原因?yàn)樵趯?shí)際檢測中，為兼顧準(zhǔn)確與效率，一般將反應(yīng)循環(huán)數(shù)設(shè)為40;因此，若陽性結(jié)果Ct值太接近循環(huán)數(shù)，不便于確定檢測結(jié)果。

在致病菌檢測領(lǐng)域，分子生物學(xué)方法較為適合。致病菌rRNA檢測方向上一般以16S rRNA為對象，但隨著基因測序的快速積累，23S、ITS也在分型鑒定中啟到重要作用。毒素基因方向上，常見致病菌如Sa. enterica、St. aureus及各血清型的毒性機(jī)理研究已頗為深入，多種相關(guān)基因已用于PCR類檢測，前景較好。

口含煙作為即食食品，除了致病菌檢測，常規(guī)微生物檢測是更重要的安全指標(biāo)。但由于分子生物學(xué)檢測的指向性較強(qiáng)，對于菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌等廣譜檢驗(yàn)反而較難適用。例如對于菌落總數(shù)、霉菌、酵母等指標(biāo)，rRNA類操縱子在不同菌種間數(shù)量差異較大，難于定量;對于大腸菌群、耐熱大腸菌群等指標(biāo)，衛(wèi)生學(xué)范圍與遺傳學(xué)范圍無法完全重合。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳超英. 變革與挑戰(zhàn)：新型煙草制品發(fā)展展望[J]. 中國煙草學(xué)報， 2017， （3）： 14-18.

[2] 食品安全抽檢監(jiān)測司. 國家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則（2021年版）[M]. 北京： 國家市場監(jiān)督管理總局， 2021.

作者簡介：傅婧，1988年5月，女，漢，籍貫：貴州省貴陽市，學(xué)歷：碩士研究生，職稱：助理工程師（初級），研究方向：煙草行業(yè)信息化建設(shè)

基金項(xiàng)目：貴州省科學(xué)技術(shù)基金（編號：黔科合字[2013]2059號）;貴州省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科研項(xiàng)目（編號：2017kj004號）。