60Co-γ射線輻照對蛹蟲草子實體生物活性成分的影響

王平 劉桂君 周思靜 喬宇琛 楊素玲

摘要 為研究60Co-γ射線輻照對蛹蟲草中4種生物活性成分的影響，采用劑量分別為5.0、10.0、15.0、20.0 kGy的60Co-γ射線輻照蛹蟲草子實體干品，采用比色法測定多糖和蟲草酸含量，最后采用高效液相色譜法測定蟲草素及腺苷的含量。結果表明，0～20 kGy劑量的60Co-γ射線輻照對蛹蟲草子實體干品中多糖、蟲草酸、蟲草素及腺苷含量的影響不顯著。因此，可采用輻照的方法對蛹蟲草子實體干品進行滅菌。

關鍵詞 子實體;多糖;蟲草酸;蟲草素;腺苷

中圖分類號 S 567.3+5? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）20-0202-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.054

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effects of 60Co-γ Ray Irradiation on the Active Components in the Fruiting Body of Cordyceps militaris

WANG Ping， LIU Gui-jun， ZHOU Si-jing et al? （Beijing Radiation Center， Beijing 100015）

Abstract In order to study the effects of 60Co-γ ray irradiation on four kinds of bioactive components in the fruiting body of Cordyceps militaris， the dried fruiting bodies of C. militarisies were irradiated with 60Co-γ? ray at the doses of 5.0， 10.0， 15.0， 20.0 kGy. The contents of polysaccharide and cordycepic acid were determined by colorimetric method， and the contents of cordycepin and adenosine were determined by high performance liquid chromatography method. The result showed that 60Co-γ ray irradiation at the irradiation dose of 0-20.0 kGy had no significant effect on the content of polysaccharide， cordycepic acid， cordycepin and adenosine in the fruiting bodies of C. militarisies. Therefore， irradiation sterilization method could be used to treat the dried fruiting bodies of C. militaris.

Key words Fruiting bodies;Polysaccharide;Cordycepic acid;Cordycepin;Adenosine

作者簡介 王平（1991—），女，北京人，工程師，從事食藥用資源的開發與利用研究。*通信作者，高級工程師，博士，從事食藥用資源的開發與利用研究。

收稿日期 2021-01-21

蛹蟲草（Cordyceps militaris）是我國傳統的食藥用菌，也是獲得國家衛生健康委員會批準的新食品原料，含有蟲草酸、蟲草素、腺苷、多糖等重要的生物活性成分[1]，具有抗腫瘤、提高免疫力、治療白血病、抗炎等多種活性作用[2-5]，具有很高的食用價值。目前市場上銷售的蛹蟲草主要是人工栽培的蛹蟲草子實體，由于在栽培及烘干等過程中的處理不當，會導致子實體干品受到污染，在儲存及運輸過程中發霉、變質，從而影響產品質量。采用輻照的方式對蛹蟲草子實體進行滅菌處理，能夠減少霉變的發生，延長子實體干品的保質期，提高產品安全性。

輻照滅菌作為一種常用的滅菌方式，在中藥材滅菌中應用較多。因此，研究輻照劑量對生物活性成分含量的影響具有重要意義，可為輻照滅菌劑量的選擇提供重要的參考依據。秦艽花中龍膽苦苷含量隨著60Co-γ射線輻照劑量的增大而明顯降低，因此秦艽花不適宜用該方法滅菌[6];李躍輝等[7]研究流通蒸汽滅菌法、微波滅菌法及60Co-γ射線輻照滅菌法對牡丹皮中活性成分丹皮酚含量的影響，結果表明60Co-γ射線輻照滅菌前后牡丹皮中丹皮酚含量基本無變化，可見60Co-γ射線輻照是牡丹皮的最佳滅菌方法;段寶忠等[8]研究不同輻照劑量對川貝母總生物堿及水溶性核苷類成分含量的影響，結果發現用6、8、10 kGy劑量輻照川貝母后，其總生物堿和水溶性核苷類成分的含量無顯著變化，適宜用輻照滅菌方法。肖滿等[9]研究60Co-γ射線輻照對三七藥材皂苷含量的影響，采用4、6、8 kGy劑量對三七進行輻照，結果發現與未輻照的三七相比，經60Co-γ射線輻照后的三七藥材中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1含量變化不顯著，說明三七可以采用輻照的方法滅菌。王春雷等[10]研究60Co-γ射線輻照對白術有效成分含量的影響，結果發現輻照劑量不超過5 kGy 時各成分含量變化不顯著;當輻照劑量為8和10 kGy時白術內酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及蒼術酮含量均有變化，且蒼術酮輻照前后含量變化顯著。鄧超[11]研究60Co-γ射線輻照對龍膽和秦艽有效成分的影響，結果發現經過輻照后龍膽和秦艽中有效成分含量大多均有不同程度降低，其中龍膽苦苷含量的降低最明顯，說明輻照對龍膽和秦艽有效成分含量有影響，需要根據情況選擇輻照劑量。

上述文獻報道表明，不同的中藥材中不同種類的生物活性物質對60Co-γ射線輻照劑量的耐受力各不相同，敏感成分會因輻照而改變其分子結構或者降解，因而不適宜采用輻照滅菌的方法，而有些中藥材的生物活性成分則對60Co-γ射線輻照不敏感，成分含量沒有顯著變化，可采用輻照滅菌的方法，因此不同的中藥材需要進行研究才能確定是否適宜用輻照滅菌方法。

在蟲草輻照滅菌研究方面，趙小俊等[12]采用8～9 kGy輻照劑量處理蟲草頭孢菌粉，其主要功能成分（腺苷、甘露醇、氮含量）及其他成分（脂肪酸、蛋白質、總糖、游離總氨基酸）含量均無顯著變化，維生素C、E的含量下降;黃志勇等[13]研究60Co-γ射線輻照對蝙蝠蛾擬青霉發酵菌粉的影響，結果表明8 kGy劑量輻照對發酵菌粉的感官質量及主要成分含量沒有影響。目前尚未見到對蛹蟲草子實體干品輻照滅菌的相關報道。筆者研究了輻照劑量對蛹蟲草子實體干品中多糖、蟲草酸（即甘露醇）、蟲草素、腺苷等重要活性成分含量的影響，旨在為蛹蟲草60Co-γ射線輻照滅菌的劑量選擇提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料。蛹蟲草子實體，由北京市輻射中心微生物實驗室固體栽培，收集子實體后60 ℃烘干。

1.1.2 試劑。蟲草素（cordycepin）、腺苷（adenosine）為HPLC級;甘露醇（mannitol）、葡萄糖（glucose）為分析純，均購自Sigma試劑公司;甲醇為HPLC級，購自上海安譜公司。

1.2 儀器與設備 主要試驗儀器有1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）、M3型多功能酶標儀（美國MD公司）、3-18k型冷凍離心機（德國Sigma公司）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛹蟲草60Co-γ射線輻照方法。為了保證輻照試驗樣品的一致性，將烘干后的蛹蟲草子實體粉碎成粉末，并混合均勻。將蛹蟲草子實體粉末分裝在相同大小的離心管中，采用北京師范大學化學學院提供的鈷源進行輻照，劑量率為50 Gy/min，輻照劑量分別為5、10、15和20 kGy，輻照時間分別為100、200、300和400 min，輻照結束后將樣品取出備用。

1.3.2 蛹蟲草子實體活性成分的提取。

取蛹蟲草子實體粉末1.0 g，加入50 mL超純水，連接冷凝回流裝置，沸水浴回流提取1 h，使用冷凍離心機8 000 r/min，離心5 min，棄沉渣，將提取液用超純水補至50 mL定容，然后用0.22 μm無菌濾膜過濾，備測。

1.3.3 多糖含量的測定。

采用苯酚-硫酸法測定葡萄糖含量，用超純水配制濃度100 μg/mL的葡萄糖標準溶液，經稀釋得到濃度分別為10、20、40、80、100 μg/mL的標準液。吸取不同濃度的標準溶液2 mL，加入6%苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，靜止10 min，搖勻，室溫放置20 min。以加入超純水的樣品為空白對照，于波長490 nm處測定光密度值[14]。以葡萄糖含量為橫坐標，以OD值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

取樣品提取液2 mL，分置不同試管中，按照標準曲線繪制方法，依次加入各試劑，測定波長490 nm處的吸光度值，每個樣品測定3個平行，根據稀釋度計算樣品中多糖的含量。

1.3.4 蟲草酸含量的測定。配制甘露醇標準溶液1 000 μg/mL，然后用超純水分別稀釋成所需濃度。取濃度分別為50、100、200、400、500 μg/mL的甘露醇標準溶液各1 mL，分置不同試管中，加入1 mL 15 mmol/L高碘酸鈉溶液混勻，室溫放置10 min后再加入2 mL 0.1% L-鼠李糖溶液，以除去過多的高碘酸鹽，混合后加入4 mL新配制的Nash試劑（150 g醋酸銨+2 mL冰醋酸+2 mL乙酰丙酮，用蒸餾水稀釋定容至1 000 mL），53 ℃下水浴加熱15 min使其呈色，冷卻，在波長412 nm處測定吸光度（OD值），根據樣品濃度與OD值的關系，繪制標準曲線[15]。

取樣品提取液1 mL，分置不同試管中，按照標準曲線的繪制方法，依次加入試劑，水浴加熱，測定波長412 nm處的吸光度值，每個樣品測定3個平行，根據稀釋度計算樣品中蟲草酸的含量。

1.3.5 蟲草素及腺苷含量的測定。配制蟲草素及腺苷標準溶液，然后梯度稀釋，蟲草素和腺苷濃度分別為10、20、40、80、100 μg/mL。采用高效液相色譜法（HPLC）測定蟲草素及核苷類物質的含量，測定方法如下：DAD檢測器，檢測波長為260 nm，色譜柱為XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，流動相為甲醇∶純水（V/V）15∶85，流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫箱溫度為25 ℃。根據標樣濃度與峰面積的關系，繪制標準曲線[15]。

按照“1.3.2”方法提取的樣品，同樣按照標準曲線的測定方法來測定，再將峰面積代入標準曲線方程，計算出樣品提取溶液濃度，最后根據稀釋度計算樣品中蟲草素及腺苷的含量。

2 結果與分析

2.1 多糖、蟲草酸、蟲草素和腺苷含量測定的標準曲線方程

根據葡萄糖濃度與OD值的關系，得到標準曲線方程y=0.007 0x-0.019 9（R2=0.999 1），表明葡萄糖濃度在0～100 μg/mL范圍內線性關系良好，可見該方法適宜測定葡萄糖濃度在該區間范圍內的樣品。根據蟲草酸濃度與OD值的關系，得到標準曲線方程y = 0.005 7x+0.007 2（R2=0.999 8），表明甘露醇濃度在0～500 μg/mL內線性關系良好，可見該方法適宜測定甘露醇濃度在該區間范圍內的樣品。根據蟲草素、腺苷的濃度與峰面積的關系，得到標準曲線方程y=40.774x+138.870（R2=0.999 1）和y=25.313x-35.662（R2=0.999 7）。這表明蟲草素、腺苷在檢測濃度范圍內線性關系良好，該方法適合測定該試驗中樣品含量。

2.2 HPLC測定蛹蟲草子座色譜圖

將蟲草素與腺苷標樣等體積混合，采用高效液相色譜法測定。樣品經過色譜柱分離后腺苷、蟲草素的保留時間分別為8.578和11.125 min，色譜圖如圖1所示，腺苷與蟲草素2個色譜峰分離較好，對于測定其含量無影響。蛹蟲草子實體回流提取后的樣品溶液采用高效液相色譜法測定，其中未經輻照的蛹蟲草子實體提取液經過色譜柱分離后如圖2所示，腺苷、蟲草素的保留時間分別為8.338和10.975 min。

2.3 蛹蟲草子實體中多糖、蟲草酸、蟲草素及腺苷的含量測定

根據比色法測定得到的蛹蟲草子實體提取液中多糖和蟲草酸含量，采用高效液相色譜法測定蟲草素及腺苷的含量，然后根據溶液的稀釋倍數計算出其在樣品中的含量，得到各個樣品中多糖、蟲草酸、蟲草素、腺苷的含量;最后，使用DPS 18.10統計軟件對試驗結果進行統計與分析，測定結果如表1所示。

由表1可知，蛹蟲草子實體多糖的平均含量為82.23～82.66 mg/g，經過不同劑量輻照后各樣品多糖含量差異不顯

著，說明0～20 kGy對蛹蟲草子實體中多糖含量的影響不大，此劑量范圍的輻照不會使多糖含量明顯降低;蛹蟲草子實體中蟲草酸的平均含量為7 272.50～7 284.10 μg/g，經過0～20 kGy 劑量的輻照后各樣品蟲草酸的含量差異不顯著，說明輻照沒有引起蟲草酸的變化，從而導致其含量升高或降低;蛹蟲草子實體中蟲草素的平均含量為4 410.90～4 420.30 μg/g，腺苷的平均含量為1 420.80～1 426.60 μg/g，經過0～20 kGy劑量的輻照各樣品蟲草素及腺苷含量差異不顯著，說明此范圍的輻照劑量對蛹蟲草子實體中蟲草素及腺苷含量的影響很小。通過對蛹蟲草子實體的活性成分含量進行統計發現，未經輻照與經過不同劑量輻照的蛹蟲草子實體多糖、蟲草酸、蟲草素、腺苷的含量無顯著差異（P>0.05），說明0～20 kGy劑量的輻照不會影響蛹蟲草子實體的品質。

3 結論

蛹蟲草子實體經過0、5、10、15、20 kGy輻照后，其多糖、蟲草酸、蟲草素、腺苷含量變化不顯著，說明0～20 kGy劑量的輻照對蛹蟲草子實體中這4種成分含量的影響較小，且這4種生物活性成分是蛹蟲草的主要成分，可見輻照滅菌對蛹蟲草子實體干品中多糖、蟲草酸、蟲草素、腺苷4種主要生物活性成分的影響小，因此該方法是一種適合于蛹蟲草子實體干品的滅菌方法。

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