不同貯藏溫度對黃瓜花粉生活力的影響

洪嘉駿 牛歡歡 李征

摘要 首先對黃瓜花粉生活力的鑒定方法進行分析，隨后對花粉管萌發檢測方法進行了優化，包括最適蔗糖濃度、最適培養觀察時間的篩選。結果表明不同蔗糖濃度的液體培養基對花粉生活力影響很大，以15%蔗糖+100 mg/kg硼酸效果最佳。培養時間方面，以培養1.5 h后觀察花粉萌發狀態最佳。隨后，分析貯藏溫度對黃瓜花粉生活力的影響。結果表明較于常溫（25 ℃恒溫貯藏）和-20 ℃恒溫貯藏，4 ℃恒溫貯藏能有效減緩花粉活性的下降速度。最后，比較了自交系與雜交商品種在不同貯藏條件下的花粉生活力。結果表明商品種相較于供試自交系，在相同貯藏條件下花粉萌發率較高，表明黃瓜花粉活性可能具有雜種優勢效應。

關鍵詞 黃瓜花粉;花粉生活力;花粉管萌發檢測法;貯藏溫度

中圖分類號 S 642.2? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）20-0057-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.016

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effect of Different Storage Temperatures on Viability of Cucumber Pollen

HONG? Jia-jun， NIU? Huan-huan， LI Zheng

（College of Horticulture， Northwest A&F Univeristy， Yangling， Shaanxi 712100）

Abstract The identification methods of cucumber pollen viability were compared and analyzed， and then the detection methods of pollen tube germination were optimized， including the selection of the optimal sucrose concentration and the optimal culture observation time. The results showed that the liquid medium with different sucrose concentration had a great influence on pollen viability， and 15% sucrose + 100 mg/kg boric acid was an optimal choice. In terms of culture time， pollen germination was the best after 1.5 h. Then， the effect of storage temperature on the viability of cucumber pollen was analyzed. The results showed that compared with normal temperature （25 ℃ storage） and -20 ℃ storage， 4 ℃ storage could effectively slow down the decline of pollen activity. Finally， the pollen viability of inbred lines and commercial hybrids under different storage conditions was compared. The results showed that the pollen germination rate of commercial varieties was higher than that of the tested inbred lines under the same storage conditions， indicating that the pollen activity of cucumber may have heterosis effect.

Key words Cucumber pollen;Pollen viability;Detection method of pollen tube germination;Storage temperature

作者簡介 洪嘉駿（1995—），男，遼寧鐵嶺人，碩士研究生，研究方向：黃瓜遺傳育種。

*通信作者，教授，博士，博士生導師，從事黃瓜遺傳育種研究。

收稿日期 2021-02-19

黃瓜是我國種植范圍最廣、面積最大的蔬菜之一。由于花器官發育的特殊性，黃瓜雜交制種一般使用人工授粉，父本花粉的質量是決定制種種子產量和品質的關鍵因素[1]。相較于其他葫蘆科植物，黃瓜花粉產量較低，且活性衰減較快，花粉離體保存較為困難。生產中，黃瓜授粉能力和花粉活力與環境溫度關系較大。黃瓜是喜溫性植物，溫度過高或過低均可以導致其授粉受精作用不良，進而影響產量和育種工作的順利進行[2-3]。

目前對花粉萌發和授粉方面的研究，在牡丹[4]、大花蕙蘭[5]等花卉植物中研究較多，相比較而言，在番茄[6-7]、西葫蘆[8]、黃瓜[3]等蔬菜中研究較少。在多年生產實踐中，發現進行黃瓜花粉的最適培養條件和貯藏條件的研究仍很有必要。這不僅可以用于黃瓜花粉的長期保存和遠距離運輸，同時也為開展如小孢子培養、花粉轉染等生物技術試驗提供材料保存方法的借鑒。筆者首先分析花粉生活力鑒定方法，篩選在液體培養條件下，花粉萌發率的最佳培養時長和培養基的最佳蔗糖濃度。隨后選擇1個黃瓜自交系和7個陜西地區主栽的雜交商品種為試材，分析不同保存溫度對黃瓜花粉生活力的影響，較全面地分析影響黃瓜花粉離體保存的因素。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃瓜標準自交系CU 雌雄異花系，秋季雄花率較高，適于大量收集花粉，由西北農林科技大學黃瓜課題組保存。雜交黃瓜商品種選擇陜西省關中地區目前主栽的商品種，包括津優1號、博耐5000、博耐35B、大宇園藝705、大宇園藝616、大宇園藝131、大宇園藝6-8。商品種由試驗當地種子市場購得。

試驗于2019年8—10月在西北農林科技大學涇陽蔬菜試驗站進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃瓜花粉生活力鑒定方法比較。

黃瓜花粉的醋酸洋紅染色法、亞歷山大染色法、TTC（? 5-氯化三苯基四氮唑）染色法和I-KI染色法分別參照Frescura等[9]、Alexander[10]、Norton[11]和Aslam等[12]的方法。花粉管萌發法采用李曉麗等[3]的方法。處理后的花粉樣品置于光學顯微鏡觀察、拍照并統計結果。

1.2.2 黃瓜花粉萌發最適蔗糖濃度液體培養基的篩選。

在含有100 mg/L硼酸水溶液中加入不同質量的蔗糖，配制蔗糖終濃度分別為0、5%、10%、15%、20%的5種液體培養基[3]。采摘當日盛開的黃瓜雄花，將花粉分別均勻散在4種液體培養基中，置于25 ℃、相對濕度80%的人工氣候箱中培養2 h后，使用顯微鏡鏡檢觀察。以花粉管萌發長度大于花粉粒直徑為標準記錄花粉萌發情況。隨機選取3個視野統計花粉發芽率。

1.2.3 黃瓜花粉萌發最適觀察時間的篩選。

采摘當日盛開的黃瓜雄花，將花粉均勻散在15%蔗糖濃度的液體培養基中，置于25 ℃、相對濕度80%的人工氣候箱中。從處理0.5 h起，間隔0.5 h觀察花粉萌發情況。隨機統計3個視野并計算萌發率。

1.2.4 不同貯藏溫度對黃瓜花粉生活力的影響。

采摘當日盛開的黃瓜雄花，取出花藥干燥3～4 h。然后將所有干燥的花藥分成3份，分別放入50 mL離心管中并貯存于-20、4和25 ℃條件下。處理開始0、3、6 h分別檢測一次花粉生活力，從3種貯藏溫度的花藥中取出3～5顆花藥，用毛筆輕刷，使花粉均勻散至培養基上。培養基配方為15%蔗糖+100 mg/L硼酸。將培養基置于25 ℃、相對濕度80%的人工氣候箱中培養1.5 h后，在光學顯微鏡下觀察3個互不重疊的視野。將花粉管萌發長度超過花粉直徑的花粉粒認定為正常萌發。隨后每天重復1次，觀察花粉萌發情況。計算0 h的花粉平均萌發率，并以其為對照，計算其他處理時間點的相對萌發率。

1.3 數據統計與分析

數據采用Microsoft Excel進行統計，處理后的結果采用SPSS（17.0）軟件按照鄧肯法分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 黃瓜花粉生活力鑒定方法篩選

首先確定黃瓜花粉生活力的檢測方法。使用I-KI、亞歷山大、醋酸洋紅染色法和花粉管萌發法分別檢測黃瓜自交系花粉的生活力，結果見圖1。I-KI溶液處理后，黃瓜花粉粒的染色情況存在明顯差異，出現藍黑色的花粉粒較少，表明黃瓜花粉的淀粉含量存在明顯差異。另一方面，亞歷山大和醋酸洋紅溶液處理后，幾乎所有黃瓜花粉粒均顯現出紫紅色和橘紅色，表明絕大部分花粉粒的染色體成分是正常的。最后，使用花粉管萌發法檢測供試黃瓜花粉，經初步條件摸索，結果發現可萌發花粉管的花粉粒約為70%，陽性花粉結果介于I-KI染色和亞歷山大＼醋酸洋紅染色結果之間。基于此結果，認為染色法檢測黃瓜花粉雖然操作簡便，但結果并不準確，因此選擇花粉管萌發法作為檢測供試黃瓜花粉生活力的首選方法，并加以優化。

2.2 黃瓜花粉萌發的液體培養基蔗糖濃度篩選

使用含有0、5%、10%、15%、20%的蔗糖培養基培養黃瓜自交系CU2的花粉，25 ℃、濕度80%的人工氣候箱中培養2 h后，花粉在5種培養基中均能萌發，但萌發率差異顯著（圖2）。在不含蔗糖（0）的培養基中，花粉平均萌發率為10.00%。隨著蔗糖濃度的提高，花粉萌發率逐漸上升，在5%和10%蔗糖濃度培養基中分別為19.20%和35.76%，在15%蔗糖濃度培養基中達到最高值71.40%。隨后，花粉平均萌發率在20%蔗糖濃度培養基中出現下降，為45.00%。統計分析表明，培養基中的蔗糖濃度為15%時，花粉萌發率與無糖培養基及蔗糖濃度5%處理呈顯著差異，而培養基中的蔗糖濃度為5%、10%和20%時差異不顯著。同時，培養基中的蔗糖濃度為15%時，花粉萌發率高于其他處理。因此，15%蔗糖培養基是供試黃瓜材料花粉萌發的最適條件。

2.3 黃瓜花粉萌發時間的篩選

使用15%蔗糖濃度液體培養基，培養黃瓜自交系CU2的花粉，在25 ℃、濕度80%的人工氣候箱中分別培養0.5、1.0、1.5和2.0 h后，觀察花粉萌發情況。結果顯示處理之間差異顯著（圖3）。培養0.5 h時花粉萌發率為0。在培養時間從0.5 h延長至1.5 h時，隨著培養時間的增加花粉萌發率顯著提高，分別為35.44%和66.63%。培養時間從1.5 h到2.0 h時，花粉萌發率增加并不顯著，最終萌發率為67.63%。同時，發現培養2.0 h后，由于花粉管生長過長，導致數據統計時容易出現偏差。基于上述結果，認為培養1.5 h后觀察花粉萌發情況是比較理想的試驗條件，并在后續研究中加以應用。

2.4 不同貯藏溫度對黃瓜花粉萌發的影響

采集黃瓜自交系CU2花藥，經干燥處理后，貯藏于不同溫度下觀察其萌發率變化情況。由于干燥處理會影響花粉生活力，因此將干燥后未經貯藏的花粉萌發情況作為參照，計算其他貯藏條件下花粉相對萌發率。結果表明（表1），貯藏在25 ℃恒溫下的花粉初期萌發情況最好，貯藏3 h后平均相對萌發率仍達84.68%。隨后，在該溫度下的萌發率快速下降，在貯藏6 h后花粉平均相對萌發率僅有40.99%，貯藏1 d后進一步下降為22.00%，三者之間有顯著差異。貯藏2和3 d后花粉萌發率降為6.57%和2.87%，兩者之間無顯著差異。在4 ℃恒溫貯藏的處理中，貯藏3 h、6 h和1 d后花粉平均相對萌發率分別為63.51%、57.34%和27.63%，前兩者無顯著差異，且與1 d處理有顯著差異。進一步貯藏2和3 d后花粉萌發率均值分別為9.79%和4.34%，兩者之間無顯著差異。在-20 ℃恒溫貯藏3 h、6 h、1 d、2 d和3 d后花粉平均相對萌發率分別為28.07%、19.18%、10.29%、6.11%和2.00%。

由圖4可知，25 ℃恒溫保存對黃瓜花粉的早期（3 h）傷害最低，但隨著時間延長，該貯藏溫度使得花粉生活力迅速下降。相比較而言，對于短期（1 d）保存黃瓜花粉，4 ℃恒溫可以更好地保存花粉生活力。而-20 ℃恒溫由于對花粉早期傷害較大，不具有明顯的黃瓜花粉貯藏優勢。進一步延長貯藏時間，發現無論以哪種溫度保存花粉，貯藏2 d后花粉基本失去活性，表明單純溫度條件仍不足以長時間有效保存黃瓜花粉。

混合采集西安市大宇園藝系列品種、津優1號等黃瓜商品種的花粉，使用相同的貯藏溫度進行處理，分析花粉平均相對萌發率的變化情況，結果表明（圖5，表2），25 ℃恒溫條件貯藏3 h花粉平均相對萌發率為80.69%，貯藏1 d后花粉萌發率均值為64.43%，貯藏2 d后花粉萌發率均值下降幅度較大，僅為4.23%，三者間有顯著差異。而延長貯藏3和4 d后，花粉幾乎完全失活。4 ℃恒溫貯藏花粉萌發率下降幅度較小，同時花粉萌發率相對較高，貯藏 3 h、1 d、2 d的花粉平均相對萌發率均值分別為80.19%、77.66%、65.99%，三者之間無顯著差異。貯藏時間延長至3和4 d后，花粉萌發率大幅度下降至12.84%和0.48%，兩者之間無顯著差異。-20 ℃恒溫條件不利于花粉的貯藏，花粉萌發率下降速度較快，同時花粉活性也不高。貯藏3 h時花粉平均相對萌發率僅為42.98%，而1 d后下降至14.26%，貯藏2 d后的花粉萌發率為4.22%，三者之間有顯著差異。繼續貯藏3、4 d后花粉的萌發率分別為4.07%和2.33%，兩者之間無顯著差異。混合花粉的貯藏結果與黃瓜自交系的分析結果一致，25 ℃恒溫條件有利于短時貯藏花粉，而4 ℃恒溫條件長時貯藏花粉的效果相對較好。

3 討論與結論

黃瓜是典型的單性花植物，雌雄蕊分別著生于獨立的花器官中。黃瓜花器官較大，單瓜結籽率較高，又由于生產多使用穴盤育苗定植，用種量較小。這些原因促使黃瓜育種中多使用人工授粉。在授粉過程中往往涉及花期不遇、雜交父母親本距離等問題，這是研究黃瓜花粉離體保存的一個重要原因。另外，近年來，利用花粉為媒介進行遺傳轉化的工作已逐漸成為研究熱點[13]，而花粉離體保存也是這些研究的前提條件。相較于西瓜、南瓜等其他葫蘆科植物，黃瓜的花藥體積較小，開裂并不充分，散粉能力較差，大量獲得花粉相對困難，因此研究如何高效地保存其花粉顯得更為重要[3]。

為了研究貯藏花粉生活力的變化情況，首先比較了黃瓜花粉生活力的檢測方法。先后分析了I-KI、亞歷山大、醋酸洋紅、TTC 4種溶液的染色效果，發現其結果并不一致。其中，亞歷山大、醋酸洋紅溶液的染色結果陽性率非常高，I-KI溶液染色的陽性率較差。然而，令人意外的是，TTC溶液并不能獲得任何陽性結果（結果未顯示）。進一步使用甜瓜、西瓜、西葫蘆分別進行上述溶液的染色分析，獲得的結果與黃瓜中基本一致。考慮到4種溶液染色的機理，推測葫蘆科花粉（包括供試的黃瓜、甜瓜、西瓜、西葫蘆）中淀粉含量和呼吸活性相對較低，其花粉生活力不適宜使用I-KI和TTC染色進行檢測。為了獲得準確的花粉生活力結果，最后采用花粉管萌發法進行檢測。經優化條件，發現供試黃瓜天然花粉的萌發率約為70%，遠高于I-KI溶液的染色結果，但明顯低于亞歷山大、醋酸洋紅溶液的染色結果。由此認為，在該研究中，花粉管萌發法是檢測黃瓜花粉生活力的唯一可靠方法。

培養基中蔗糖濃度過高或過低都不利于花粉管的萌發，發現黃瓜花粉在蔗糖濃度為15%的液體培養基中具有較高的萌發能力。當然，由于所選擇蔗糖濃度梯度的原因，不排除在15%左右范圍內更適合的蔗糖濃度，未來需要更精細的試驗檢驗該結果。使用液體培養基培養花粉，當培養時間在1.5 h左右時花粉萌發率較高。當培養時間繼續延長時（1.5～2.0 h）花粉萌發情況增加不明顯，但已萌發的花粉管伸長較為顯著，對結果觀察統計產生明顯阻礙，因此，認為選擇培養1.5 h后觀察黃瓜花粉（管）萌發情況較為合適，能夠有較好的觀察效果。

在不同溫度貯藏黃瓜花粉研究中，發現無論是自交系還是黃瓜商品種的混合花粉，25 ℃恒溫貯藏均可短時保存花粉，但長時保存花粉萌發率下降較快;4 ℃恒溫貯藏能較好的長時間保持花粉活性;-20 ℃恒溫貯藏花粉能最大化減緩花粉萌發率的下降速度，但花粉初始萌發率較低。25 ℃處理的結果表明，在正常生理條件下，干燥黃瓜花粉活性喪失較快，與文獻[1-3]和育種實踐的經驗觀察一致。詳細分析-20 ℃處理的結果可以發現，在該溫度下花粉生活力的下降最緩慢，只是由于低溫對花粉的初始傷害較大，導致該溫度處理不能有效保存黃瓜花粉。推測該現象可能是由于花粉的干燥處理不夠徹底造成的。

比較有趣的現象是，黃瓜商品種的花粉與自交系相比，雖然短時貯藏相對萌發率（25 ℃處理3 h時分別為80.69%和84.68%）差異不大，但貯藏時間延長后表現出明顯的優勢，25 ℃處理1 d時萌發率分別為64 .43%和22.00%，4 ℃處理1 d時萌發率分別為77.66%和27.63%。進一步延長時間，發現商品種的花粉甚至在4 ℃處理2 d時仍能保持相對理想的萌發率（65.99%）。推測黃瓜花粉的這一現象可能與商品種的雜合遺傳背景有關，可能涉及雜種優勢現象，需要進一步研究。

綜合該研究結果，認為黃瓜花粉生活力的最適檢測方法是花粉管萌發法，該方法使用的液體培養基中蔗糖的最適濃度是15%，最適培養時間是1.5 h。干燥黃瓜花粉短時（1 d以內）保存可以選擇25 ℃，延長（2 d以內）保存應選擇4 ℃。

參考文獻

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