表面活性劑協同雙頻超聲波輔助提取香菇多糖工藝及抗氧化活性研究

謝鵬，高愿軍，秦令祥，周婧琦

（1.漯河食品職業學院，河南漯河462300；2.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南鄭州450002；3.漯河市食品研究院有限公司，河南漯河462300）

香菇，也被稱為花菇、香蘑等，屬擔子菌綱傘菌目口蘑科香菇屬[1]，起源于中國，是中國著名的食藥兩用食用菌[2]，也是全球第二大食用菌。它營養豐富，口味獨特，食用和藥用價值很高[3]，有“菌菇皇后”、“菇中之王”之稱[4]。香菇多糖（lentinan，LNT）是香菇中重要生物活性成分。LNT 具有抗病毒[5]、抗腫瘤[6]、抗氧化[7]、增強免疫力[8]、抗輻射[9]、降血糖[10]、抗衰老[11]等功效，在食品、保健、生物醫藥和臨床等方面被廣泛應用[12]。

目前，提取多糖的方法主要有熱水浸提、酶解[13]、微波輔助[14]、超聲波輔助[15]等，這些方法各有優劣。表面活性劑提取是近年發展起來的一種先進的提取方法，它利用其潤濕、滲透和增溶的作用，來提高提取效率，它具有條件溫和、成本低、環保、安全的優點，可工業化應用[16-18]。雙頻超聲輔助提取是一種新的現代提取方法，該方法避免了單頻超聲聲場不均勻、空化效應不完全而影響提取效率的問題[19]。吐溫食品級表面活性劑具有經濟、方便、低毒等優點，越來越多地用于保健食品的提取[20]。本研究通過表面活性劑協同雙頻超聲波輔助提取LNT，來增強LNT提取效果，并對其抗氧化活性進行研究，為后續LNT的開發利用和工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇：西峽縣雷氏菇品購銷有限公司；吐溫-80（Tw-80）、葡萄糖、苯酚、硫酸、無水乙醇、正丁醇、三氯甲烷（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；聯苯雙酯、四氯化碳（均為分析純）：鄭州化學試劑廠；DPPH試劑：上海浩洋生物科技有限公司；維生素C：華北制藥股份有限公司；水楊酸、硫酸亞鐵、H2O2（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

智能溫控雙頻超聲波萃取儀（BILON-2009）：上海比朗儀器制造有限公司；旋轉蒸發器（RE-3000A）：上海耀特儀器設備有限公司；紫外-可見分光光度計（760CRT）：上海儀電分析儀器有限公司；電動攪拌器（D2015W）：上海梅穎浦儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 LNT的提取

香菇→干燥→粉碎→過80目篩→密封保存備用→稱取一定質量的香菇粉末→加入一定濃度的吐溫-80溶液→雙頻超聲波輔助提取→提取液Sevag法[21]脫蛋白→離心（5 000 r/min，10 min）→上清液旋轉蒸發濃縮→3倍體積95%乙醇進行沉淀→放入4℃冰箱，靜置24 h→離心（5 000 r/min，10 min）→真空冷凍干燥→香菇粗多糖。

1.3.2 LNT的測定

LNT的測定采用苯酚-硫酸法[22]。

1.3.3 LNT提取率的計算

LNT提取率的計算公式如下。

提取率/%=（提取的多糖量/提取的香菇粉樣品量）×100

1.3.4 LNT提取試驗設計

1.3.4.1 單因素試驗設計

按1.3.1的方法，稱取10 g香菇粉5份進行表面活性劑協同雙頻超聲波輔助提取LNT，研究不同因素對LNT提取率的影響。固定條件：料液比1∶30（g/mL）、表面活性劑用量2.0%、超聲頻率（20+40）kHz，超聲時間 30 min。分別設定料液比為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），表面活性劑用量為 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，超聲頻率為（20+35）、（25+35）、（20+40）、（25+40）、（35+40）kHz，超聲時間為 20、25、30、35、40 min，進行單因素試驗。每組重復3次，取平均值。

1.3.4.2 正交試驗設計

在預試驗和單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗優化提取工藝。試驗水平設計見表1。

1.3.5 LNT的抗氧化活性試驗設計

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測定

參照秦生華等[23]的方法，在517 nm波長處測吸光度。按下式計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白組的吸光度；A1為樣品組或陽性對照組的吸光度；A2為對照組吸光度。

1.3.5.2 羥基自由基清除率的測定

參照扈芷怡等[24]的方法，在510 nm波長處測吸光度。按下式計算羥基自由基自由基清除率。

式中：A3為空白組的吸光度；A4為樣品組或陽性對照組的吸光度；A5為對照組吸光度。

1.3.6 數據處理

試驗數據采用Excel整理，數據分析采用正交設計助手進行。

2 結果與分析

2.1 LNT提取工藝條件優化

2.1.1 料液比對多糖提取率的影響

料液比對香菇多糖提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對香菇多糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ration on the lentinan extraction rate

由圖1可知，隨著溶劑用量的增加，LNT提取率先升高后略微降低。這是因為增加溶劑用量，溶液黏度會減小，多糖擴散和傳質速率增加，利于多糖溶出和提取率升高。但料液比達到1∶30（g/mL）時，多糖基本完全溶出，再增加溶劑用量，其它雜質也可能被溶出，影響提取率，使提取率略微下降。這與韓淑琴等[25]的研究結果趨勢相似。因此，取料液比1∶30（g/mL）為佳。

2.1.2 表面活性劑用量對多糖提取率的影響

表面活性劑用量對香菇多糖提取率的影響見圖2。

圖2 表面活性劑用量對香菇多糖提取率的影響Fig.2 Effect of surfactant dosage on the lentinan extraction rate

由圖2可知，隨表面活性劑用量的增大，LNT提取率先升高后降低。這是因為，增大表面活性劑用量，多糖的增溶和擴散作用增強，多糖溶出增多，提取率升高；當表面活性劑達到2.0%時，其增溶和擴散作用達到最大，再繼續增大用量，多糖溶出也不會明顯升高，而趨于穩定。這與洪松彬等[26]的研究結果基本相似。因此，取表面活性劑用量2.0%為佳。

2.1.3 超聲頻率對多糖提取率的影響

超聲頻率對香菇多糖提取率的影響見圖3。

圖3 超聲頻率對香菇多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic frequency on the lentinan extraction rate

由圖3可知，隨著超聲頻率的變化，LNT提取率先升高再降低。這是因為增加超聲頻率，其空化和機械作用增強，多糖的溶出增多，提取率升高。但當超聲頻率超過（20+40）kHz時，再繼續增加超聲頻率，一是多糖的結構會被部分破壞，二是其它雜質也會溶出，影響了多糖的溶解，降低提取率。這與楊麗維等[27]的研究結果基本一致。因此，取超聲頻率（20+40）kHz為佳。

2.1.4 超聲時間對多糖提取率的影響

超聲時間對香菇多糖提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時間對香菇多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the lentinan extraction rate

由圖4可知，隨著超聲時間的增加，LNT提取率先升高后緩慢下降。這是因為增加超聲時間，多糖受到表面活性劑增溶和超聲波空化作用的增強，多糖溶出加快，提取率升高。但當超聲時間達到30 min時，增溶基本完全，再增加超聲時間，多糖的部分結構會被不同程度的破壞，降低提取率。這與楊麗維等[27]的研究結果相近。因此，取提取時間30 min為佳。

2.1.5 LNT提取正交試驗結果

LNT提取的正交試驗結果見表2，LNT提取的方差分析結果見表3。

表2 正交試驗結果Table 2 The result of orthogonal experimental design

表3 方差分析結果Table 3 The variance analysis results

由表2、表3結果分析可知，各因素影響順序為A＞B＞C＞D，最優組合為 A3B3C3D1。料液比、表面活性劑用量和超聲頻率對LNT提取率的影響顯著，其它不顯著。通過K值的分析，確定最佳工藝參數為料液比1∶40（g/mL），表面活性劑用量 2.5%，超聲頻率（25+40）kHz和超聲時間25 min。在此最佳條件下做驗證試驗，重復5次，LNT提取率分別為14.13%、14.15%、14.18%、14.19%、14.17%，平均為14.16%（5次平均值），相對標準偏差為0.17%（n=5），表明此優化工藝方法穩定可靠。

2.2 對比試驗

為了對比表面活性劑協同雙頻超聲波輔助提取法與單一超聲輔助和單一表面活性劑法提取LNT不同，根據付麗娜等[28]超聲波提取條件略有改變和楊靜娟等[29]表面活性劑提取條件略有改變，研究不同提取方式對LNT提取率的影響見表4。

表4 不同提取方法對LNT提取率的影響Table 4 Effect of different extraction methods on the extraction rate of LNT

由表4可知，表面活性劑協同雙頻超聲波輔助提取LNT與其它兩種方法相比，所得LNT提取率明顯提高，并且提取時間比其它兩種方法更短，說明表面活性劑協同雙頻超聲波輔助提取LNT更高效、省時。

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 LNT對DPPH自由基清除率的影響

LNT對DPPH自由基清除率的影響見圖5。

圖5 LNT對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of LNT on the clearance rate of DPPH free radicals

由圖5可知，在試驗測定的質量濃度范圍內，隨著LNT質量濃度的增加，對DPPH自由基清除率逐漸增強。當LNT質量濃度為25 mg/mL時，清除率為78.51%，與相同質量濃度的VC的清除率相近，表明其對DPPH自由基具有較強的清除能力。

2.3.2 LNT對羥基自由基的清除率的影響

LNT對羥基自由基清除率的影響見圖6。

圖6 LNT對羥基自由基清除率的影響Fig.6 Effect of LNT on the clearance rate of OH·free radicals

由圖6可知，在試驗測定的質量濃度范圍內，隨著LNT濃度的增加，對羥基自由基的清除率逐漸增強，并呈現良好的正相關，當LNT質量濃度為25 mg/mL時，清除率為82.28%，其清除率和VC相近，表明其對羥基自由基具有較強的清除能力。

3 結論

本試驗工藝采用表面活性劑協同雙頻超聲波輔助提取 LNT，得到最優工藝條件：料液比 1∶40（g/mL），表面活性劑用量2.5%，超聲頻率（25+40）kHz，超聲時間25 min。在此條件下，LNT提取率為14.16%。該方法高效、環保、易操作。LNT抗氧化活性研究表明，在一定的質量濃度范圍內，LNT對DPPH自由基和羥基自由基的清除率隨著質量濃度的增加而升高，當LNT質量濃度為25 mg/mL時，其對DPPH自由基和羥基自由基的清除率分別為78.51%和82.28%，表明LNT具有較強的抗氧化活性。本試驗工藝方法可為LNT的提取與工業應用提供一種參考，而對LNT結構、組成及其生物活性的影響等，有待進一步研究。