雪茄煙葉精油主要成分分析及作用評價

徐秀娟，魯 平，史清照，陳孟起，楊春強，屈 展，崔 凱，李明哲,何保江*，胡少東*

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號450001

2.河南中煙工業有限責任公司技術中心，鄭州經濟技術開發區第三大街8號450000

雪茄煙是全部用雪茄煙葉卷制成的卷煙產品，抽吸時具有典型的雪茄風格，具體表現為香氣量足、吃味好、微苦，余味舒適，煙氣煙堿釋放量高，勁頭較大，煙氣成堿性［1］。近年來，我國雪茄煙市場持續升溫，特別是高檔雪茄煙需求量不斷增加，發展前景良好。

與卷煙相比，雪茄煙僅由5種左右的煙葉原料組成，因而煙葉品質對產品的質量影響極大。與進口雪茄煙葉相比，國產雪茄煙葉化學成分（總氮、總植物堿、鉀、氯等）的組成存在顯著差異，感官質量整體偏低，特征香味較弱，香氣濃度不足，勁頭偏大，雜氣明顯，苦味和澀味較重［2-6］，難于滿足雪茄煙產品配方需要，國內煙草行業中高端雪茄煙的茄衣、茄套、茄芯原料基本依賴進口。國內雪茄煙起步較晚，目前對雪茄煙葉的研究主要集中在品種選育、栽培、調制、發酵以及常規化學成分分析等方面，對于雪茄煙葉致香成分的研究較少［7-10］。趙瑞等［11］研究了國內外不同雪茄煙茄芯原料主要化學成分與感官品質之間的關聯；王玉華等［12］分析了國內外不同產區雪茄煙茄芯原料中的部分中性致香成分并進行相關性分析，發現類胡蘿卜素降解產物與新植二烯的相關性密切（相關系數為0.98）；李浩等［13］分析了四川不同產區雪茄煙葉的理化指標和致香成分的質量分數，并與印尼雪茄煙葉進行對比，結果表明，四川雪茄煙葉新植二烯和香葉基丙酮質量分數高于印尼，其他質體色素降解產物總量較低。香味成分是煙葉風味特征的重要物質基礎，與煙葉香氣質量關系密切，針對煙草香氣成分的分析研究早已成為煙草化學研究的熱點之一。然而，雪茄煙葉的致香成分及其與感官質量的關系研究鮮見文獻報道。為此，采用亞臨界萃取和分子蒸餾技術制備雪茄煙葉精油，并進行成分分析，探明蒸餾溫度對煙堿、酮類、酯類、有機酸類等成分富集效果的影響，以及不同蒸餾溫度下煙草精油的感官作用差異，為雪茄煙葉特征致香成分的定向富集提供理論基礎；采用簡單相關分析方法對雪茄煙葉部分致香成分與卷煙感官評價指標進行關聯，找出對煙葉香氣質量影響較大的致香成分因子，為雪茄煙葉的質量評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

雪茄煙葉（建恒4號，由河南中煙工業有限責任公司提供）；參比卷煙：“紅旗渠”（雪茄）卷煙，卷煙紙為白色未加香。

乙酸苯乙酯［色譜純，阿拉丁試劑（中國）有限責任公司］；液氮（河南源正科技發展有限公司）；食用乙醇（AR，新鄉酒精廠）；二甲醚（AR，中油化工有限責任公司）；尼龍66濾膜（0.22 μm，天津津騰公司）。

CP224S型電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius公司）；R-210旋轉蒸發儀（瑞士Büchi公司）；7890GC-5977MS氣質聯用色譜儀（美國Agilent公司）；DLSB-5/20低溫冷卻循環泵（鄭州長城儀器有限公司）；HH-ZKYY多功能油浴鍋（鞏義市予華儀器有限公司）；PL6500低溫冰箱（美國Thermo Fisher公司）；CBE-5L型亞臨界溶劑小樣處理設備（河南省亞臨界生物技術有限公司）；SY-Ⅲ-A型實驗用煙草處理機（河南富邦實業有限公司）；FW-200型中藥粉碎機（浙江永康帥通工具有限公司）；KDL 5分子蒸餾儀（德國UIC公司）。

1.2 方法

1.2.1 雪茄煙葉精油的制備

亞臨界萃取法：將煙葉粉碎后裝入孔徑75 μm（200目）樣品袋中，送入萃取罐中，再加入95%乙醇作為夾帶劑（用量為二甲醚的0.05倍），抽真空并向萃取罐內注入萃取溶劑二甲醚，控制料液比m煙粉∶m二甲醚=1∶20，萃取溫度為30℃，萃取時間為20 min，萃取3次。萃取結束后，減壓脫除溶劑，得到粗提物。在攪拌下向煙草浸膏中緩慢倒入10倍量的95%乙醇，加熱至50℃，保持40 min使其充分溶解。待溶液冷卻至室溫后，轉移至-20℃冰箱中冷凍過夜。抽濾后，在0.01 MPa、浴溫35℃條件下將濾液濃縮至無溶劑，得到雪茄煙葉凈油1#樣品，產率5.2%。

分子蒸餾法：①稱取158.9 g雪茄煙葉凈油1#樣品，在蒸餾溫度60℃、壓力0.1 Pa、進料速度1.5 mL/min、攪拌速度160 r/min條件下，分別收集輕、重組分；②將收集到的重組分進行二級蒸餾，蒸餾溫度為80℃，分別收集輕、重組分；③將收集到的重組分進行三級蒸餾，蒸餾溫度為100℃，收集輕、重組分；④將重組分進行四級蒸餾，蒸餾溫度為120℃，收集輕、重組分。經上述逐級蒸餾后共得到4個輕組分樣品，分別為2#（60℃，5.2 g）、3#（60~80℃，3.16 g）、4#（80~100℃，2.88 g）、5#（100~120℃，4.44 g），以及120℃重組分（6#，104.56 g）。

1.2.2 雪茄精油成分分析

雪茄精油成分分析以乙酸苯乙酯為內標，采用半定量的方法進行分析。分別稱量100 mg樣品，用乙醇溶解并定容至5 mL，加入100 μL 5.43 mg/mL乙酸苯乙酯的無水乙醇溶液作為內標，進行GC/MS分析。分析條件：

色譜柱：DB-WAXetr毛細管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；進樣口溫度：250℃；載氣：高純氦氣，流速1.0 mL/min；進樣量：1 μL；分流比：10∶1；程序升溫電離方式：EI；離子源溫度：230℃；電子能量：70 eV；四極桿溫度：150℃；電子倍增器電壓：1.89 kV；質量掃描范圍：33~500 amu；掃描方式：全掃描；溶劑延遲：10.0 min。

1.2.3 感官評價

挑選質量為（0.815±0.07）g、吸阻為（1 100±200）Pa的空白卷煙樣品，將1#~6#樣品均用95%食用乙醇稀釋至質量濃度為10%，用毛筆均勻刷涂于卷煙紙上，涂布量為煙支質量的0.3%（濕重）。涂布完畢后，將卷煙裝入煙盒中，密封于（22±2）℃和相對濕度（RH）（60±5）%的條件下放置1周。感官評價方法借鑒GB 15269.4—2011［14］和YC/T 497—2014［15］，結合雪茄煙的風格特征，制定了包含品質特征、味覺特征和風格特征共計23項指標的評價表，其中品質特征包含香氣、豐濃、雜氣、刺激和細柔；味覺特征包含酸味、甜味、苦味和綜合味覺；風格特征包含干草香、樹脂香、木香、辛香、焦香、可可香、烘焙香、奶香、酸香、豆香、蜜甜香、果香和花香。請7位已取得卷煙感官評吸資格證書的專業人員根據擬定的感官特征評價表進行評價，感官評價結果采用算術平均值進行統計。

1.2.4 相關分析

采用SPSS 18.0軟件對部分化學成分和感官指標進行簡單相關分析，P＜0.05為顯著相關，P＜0.01為極顯著相關。用于相關分析的化合物有甲酸、乙酸、丙酸、2-甲基丙酸、丁酸、3-甲基丁酸、2-甲基-2-丁烯酸、戊酸、3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、正己酸、壬酸、苯甲酸、苯乙酸、6-甲基-5-庚烯-2-酮、對甲基苯乙酮、乙酰丙酮、二氫-β-紫羅蘭酮、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、巨豆三烯酮、金合歡基丙酮、3-羥基-β-二氫大馬酮、4-乙基吡啶、2，3'-聯吡啶、（E）-橙花叔醇、羅漢柏烯、西柏烯、新植二烯、5-乙酰氧基甲基-2-呋喃甲醛、苯乙醇、3，5，5-三甲基-4-（3-羥基-1-丁炔基）-2-環己烯-1-醇、二氫獼猴桃內酯、（6R，7E，9R）-9-羥基-4，7-巨豆二烯-3-酮，共34種。根據雪茄煙香氣豐富濃郁，口感舒適，蜜甜香、酸香、木香等香韻突出的風格特征，在進行相關性分析時，重點考察香氣、豐濃、綜合味覺、木香、酸香、烘焙香和蜜甜香等指標。

2 結果與討論

2.1 雪茄煙葉精油成分分析及感官作用評價

目前，揮發性植物精油的富集方法主要有水蒸氣蒸餾法、壓榨法、溶劑提取法，以及新興的超臨界萃取法、亞臨界萃取法等［16］。水蒸氣蒸餾法是根據植物揮發油中各組分蒸汽壓差異，將揮發油與水蒸氣一起蒸餾而出，需在較高的溫度下進行，且提取時間長，容易造成熱敏性、易水解物質的熱分解，導致部分有效成分損失。溶劑萃取法在提取植物精油時，需使用有機溶劑，提取時間長，提取物需進一步濃縮，易導致部分揮發油損失。與傳統提取方法相比，超臨界萃取和亞臨界萃取法均是利用溫度和壓力的變化改變流體溶解能力，使溶質和溶劑分離，從而一步化實現萃取分離。與超臨界萃取相比，亞臨界萃取的操作壓力較低，且可在室溫或更低的溫度下萃取，最大化地保護熱敏性成分不被破壞［17］。因而，本研究中采用亞臨界萃取法，以二甲醚為溶劑，95%乙醇為夾帶劑萃取雪茄煙葉；采用乙醇溶解、低溫冷凍的方式脫除植物蠟質，得到雪茄煙葉凈油。為進一步實現致香成分的富集，采用分子蒸餾技術在60~120℃條件下逐級分離，得到4種雪茄煙葉精油，其物理形態及產率如表1所示。4種精油中，2#的產率最高，4#的產率最低；且隨蒸餾溫度的升高，精油的流動性減弱，由可流動的液體逐漸轉變為不可流動的黏稠物。這與組分中高沸點大分子物質的質量分數逐漸增大有關。

表1 2#~5#精油樣品的分離溫度、產率及物理狀態Tab.1 Distillation temperatures,yields and physical properties of essential oil samples 2#-5#

對1#~5#精油樣品進行GC-MS分析，結果見表2。共鑒定出126種化合物，主要包括烷烴23種、烯烴26種、有機酸17種、酮類化合物22種、醇類化合物17種、含氮雜環化合物10種、酯類化合物6種等。整體而言，與烤煙類似，質量分數最高的為煙堿和新植二烯，2#精油中煙堿質量分數高達188.35 mg/g，3#精油中新植二烯的質量分數最高（551.20 mg/g）。隨蒸餾溫度的變化，各精油樣品的物質組成及質量分數均有較大差異，其中2#精油中鑒定出的成分多達109種，而5#精油僅有44種。從總量上看，1#精油的揮發性成分質量分數較低，僅為176.84 mg/g；隨蒸餾溫度的升高，揮發性物質的總量先升高后降低，其中3#高達原樣的4.98倍（880.38 mg/g）。這表明，分子蒸餾法能夠有效富集揮發性致香成分，且雪茄精油的揮發性物質主要集中在100℃以下的流份中，100℃以上的揮發性成分的總量較低。蒸餾溫度較低時，低沸點、弱極性的烷烴、烯烴類物質被富集，2#精油中烷烴的種類最多（21種）、質量分數最高（共計9.94 mg/g）；烯烴也多達23種，質量分數以新植二烯為主。隨蒸餾溫度的升高，高沸點物質的質量分數逐漸增大，如亞麻酸、亞油酸在5#樣品中質量分數最高。1#~5#樣品中各類物質組成如表3所示，總體而言，醇類、酮類、有機酸、烯烴（不含新植二烯）的質量分數較高，酯類、烷烴、含N雜環（不含煙堿）、含S雜環及苯系物的質量分數較低。不同蒸餾溫度下有機酸的總量變化不大，最高的為5#（25.52 mg/g），最低的為2#（13.97 mg/g）；而酮類和醇類的差別較大，其中酮類成分質量分數最高的達47.17 mg/g（3#），最低的僅為6.86 mg/g（5#）；醇類質量分數最高的4#樣品是最低的2#的5.65倍。

表2 （續）

表2 （續）

表2 雪茄煙葉精油的GC-MS分析結果Tab.2 GC-MS analysis results of essential oil of cigar tobacco

表3 雪茄精油中各類致香成分組成Tab.3 Composition of different kinds of aroma components in essential oil of cigar tobacco （mg·g－1）

此外，各類致香成分質量分數隨溫度的升高，其變化趨勢也不同（圖1）。烷烴類、酯類和含N雜環成分的質量分數隨蒸餾溫度的升高而降低，烯烴類、酮類和醇類成分先升高后降低，有機酸類物質隨蒸餾溫度的升高而升高。由表2可知，小分子有機酸，如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、苯甲酸和苯乙酸等多在80℃以下被蒸出，而高碳脂肪酸，如亞麻酸、亞油酸等在高于80℃的餾分中質量分數較高。由此可見，有機酸的質量分數隨蒸餾溫度的升高而增大主要是由亞麻酸、亞油酸質量分數的增加引起的。小分子有機酸通常具有酸香、甜香，可改善煙氣吃味，如3-甲基戊酸可增加甜味，似乳酪，水果香味［18］；而長鏈有機酸會增加煙氣蠟味、刺激性。由此可見，調節蒸餾溫度會影響精油中有機酸的組成，在較低的溫度下可富集對卷煙煙氣酸香起重要作用的成分，降低長鏈脂肪酸的質量分數。

圖1 雪茄煙葉精油中各種類致香成分的組成Fig.1 Composition of different kinds of aroma components in essential oil of cigar tobacco

煙堿質量分數高低對提取物的感官品質影響顯著，因而如何調控煙堿質量分數尤為重要。含N雜環主要由煙堿、麥斯明、二烯煙堿、2，3'-聯吡啶等組成，其中煙堿占總量的91.15%~95.55%。蒸餾前，1#樣品中煙堿質量分數僅為39.00 mg/g，蒸餾后質量分數高達原來的4.8倍（2#）。隨蒸餾溫度的升高，煙堿質量分數逐漸降低，當蒸餾溫度為120℃時，煙堿質量分數降低至34.69 mg/g。烷烴類成分與煙堿的變化趨勢相同，均隨蒸餾溫度的升高而降低。當蒸餾溫度為60℃時，烷烴的質量分數是1#樣品的1.83倍；而當蒸餾溫度升高時，烷烴的質量分數和種類均大大降低，其中，3#樣品烷烴質量分數最低。

酮類成分的質量分數隨蒸餾溫度的升高先增加后降低，3#樣品的最高。酮類成分中含大量煙草特征致香成分，如巨豆三烯酮、金合歡基丙酮、β-紫羅蘭酮、3-羥基-β-二氫大馬酮等，其質量分數高低對精油的感官質量影響較大。3#樣品中，金合歡基丙酮的質量分數高達13.43 mg/g；但隨蒸餾溫度的升高，5#樣品中僅為1.60 mg/g，降低了88.11%。由表2可知，酯類成分中，除長鏈脂肪酸酯外，二氫獼猴桃內酯對卷煙香氣的貢獻較大，該成分隨蒸餾溫度的升高而降低，且在80℃時被完全蒸出。而長鏈脂肪酸酯在高沸點組分中的質量分數較高。

由此可見，在煙草提取物分離時，為了降低烷烴、煙堿等的質量分數，同時有效富集關鍵致香成分，可以先采用較低的蒸餾溫度去除大部分烷烴及部分煙堿，再次蒸餾降低長鏈脂肪酸酯的質量分數，從而提高關鍵致香成分的質量分數。為驗證該方法對煙草提取物品質改善的實際效果，將所有樣品等量涂布于參比卷煙上，進行感官作用評價，結果如表4所示。

表4 1#~5#雪茄精油應用在參比卷煙上的感官評價得分①Tab.4 Sensory evaluation scores of cigar essential oil samples No.1#-5# when applied to reference cigarettes

品質特征方面，與空白卷煙相比，所有樣品均能較好地提高香氣，增加煙氣濃度，使煙氣細柔回甜；與未蒸餾樣品1#相比，2#和3#對提高卷煙感官品質有顯著作用，不僅可增濃煙香，還可降低煙氣雜氣與刺激性，改善口腔舒適性。隨著蒸餾溫度的升高，樣品4#和5#對香氣和濃度的改善弱于1#，且雜氣和刺激性增大，綜合味覺變差。風格特征方面，雪茄煙葉精油對卷煙香氣風格的改善主要體現在干草香、焦香、烘焙香、奶香、酸香和蜜甜香，與樣品1#相比，3#的焦香、可可香、烘焙香、酸香和蜜甜香均有改善，5#的干草香、木香有明顯改善。整體而言，3#（60~80℃輕組分）對品質和香氣風格的改善均較好，能夠增加香氣量，增加煙氣濃度，較好地凸顯雪茄風格特征，這與成分分析的結果相吻合。

2.2 部分致香成分與感官指標的相關分析

為進一步探究對感官品質影響較大的雪茄煙葉致香成分因子，選定雪茄感官特征的重點指標香氣、豐濃、綜合味覺、木香、烘焙香、酸香、蜜甜香，結合參考文獻［19-21］，從表2中篩選出34種可能有相關性的化合物，采用簡單相關分析方法進行數據處理，有顯著相關性的結果見表5。

表5 部分致香成分與雪茄特征指標的相關性①Tab.5 Correlations between some aroma components and cigar characteristic indexes

對香氣指標而言，顯著正相關影響的因素有香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、巨豆三烯酮、二氫獼猴桃內酯、金合歡基丙酮和苯乙酸，顯著負相關影響的因素為甲基苯乙酮，這與文獻［19］的結論基本一致。綜合味覺的極顯著相關影響因素較多，如乙酸、丙酸、苯乙酸、香葉基丙酮等9種化合物，這可能與酸類成分可以調節煙堿存在形態，從而改善卷煙口腔舒適性有一定關系。二氫-β-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮和羅漢柏烯與木香呈顯著正相關關系，其中羅漢柏烯是柏木油的重要組成成分，木香香韻明顯。對于烘焙香指標，西柏烯和3-甲基戊酸分別是顯著正相關和負相關影響因素；4-甲基戊酸、正己酸是極顯著負相關影響因素，該結果與理論知識差異較大，這可能與烘焙香物質的種類較少、質量分數較低有關，同時本研究中所采用的評價方法，對香氣指標的打分分值差距較小，也可能導致相關性結果出現一定的偏差。乙酸、3-甲基丁酸、3-甲基戊酸和（E）-橙花叔醇是蜜甜香的顯著正相關影響因素，4-甲基戊酸、2-甲基-2-丁烯酸是極顯著正相關影響因素。

3 結論

①低溫蒸餾（60~80℃），可降低煙堿、烷烴以及長鏈脂肪酸酯的質量分數，實現致香成分的有效富集；②與卷煙香氣密切相關的成分有香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、巨豆三烯酮、二氫獼猴桃內酯、金合歡基丙酮和苯乙酸等；③與綜合味覺密切相關的成分有乙酸、丙酸、正己酸等，其中，香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、苯乙酸均與香氣顯著正相關，與綜合味覺極顯著正相關，這些成分可以作為雪茄煙葉精油質量評價的主要指標。