煙草根結線蟲病防治藥劑對根際土壤細菌群落結構的影響

黃 闊，葉長文*，李 棟，李青常，賀 琛，楊國濤，王 勇，龍 崗，丁 偉

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號450001

2.西南大學植物保護學院，重慶市北碚區天生路2號400715

3.四川省煙草公司涼山州公司，四川省西昌市山岔東路478號615000

4.涼山州煙草公司會理分公司，四川省會理縣順城東路68號615100

煙草根結線蟲病是由根結線蟲侵染所引起的土傳病害［1］，在世界范圍內發生范圍廣、危害重、防治難［2］，嚴重影響煙葉的品質和質量，造成巨大的經濟損失［3］。

目前生產上煙草根結線蟲病防治仍然以化學藥劑為主，常采用質量分數為0.5%的阿維菌素、質量分數為10%的噻唑膦或質量分數為20%的丁硫·克百威等，于移栽期穴施或者生長期灌根。化學藥劑防效雖好，但靶向性較差，易破壞煙田土壤生態平衡，還可能造成煙葉農殘超標，根結線蟲抗藥性增強。研究表明，枯草芽孢桿菌［4］、熒光假單胞桿菌［5］、淡紫擬青霉［6］、哈茨木霉［7］等微生物菌劑作為植物根際促生菌，能夠通過改變根際微生物群落結構，促進微生物對碳源的代謝能力，同時抑制病原菌繁殖，促進植物生長，且對煙草根結線蟲病具有一定的防治效果［8-9］。然而，關于防治煙草根結線蟲病的藥劑處理對煙株根際細菌群落結構的影響和優勢菌群的變化情況鮮見報道。為此，本研究中采用16S rRNA高通量測序技術，分析了防治煙草根結線蟲病藥劑處理后煙株的根際細菌微生物群落結構和優勢菌群的變化，旨在探究藥劑處理對根際細菌群落的穩定性、優勢菌群及差異菌群的影響，探明藥劑調控的關鍵生物因子，為農業生產中有效防治煙草根結線蟲病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地情況

供試品種為紅花大金元，由四川省涼山彝族自治州會理縣益門煙葉工作站提供。

試驗地位于四川省涼山彝族自治州會理縣益門鎮大磨村2組試驗煙田，海拔2 110 m、經度E102°16'56''、緯度N26°49'44''，地塊平整，試驗田連續3年發生根結線蟲病。

試驗地面積為0.2 hm2，土壤類型為紅壤。土壤基本理化性狀：pH 5.0、有機質36.9 g/kg、全氮1.99 g/kg、全磷1.27 g/kg、全鉀15.9 g/kg、堿解氮176 mg/kg、有效磷26 mg/kg、速效鉀400 mg/kg。

1.2 試驗設計

試驗地于2018年4月18日開始移栽，移栽當天進行施藥處理。

試驗設7個處理，每處理3次重復，共21個小區，每小區面積為72 m2（約120株煙），兩邊設置保護行。本試驗中各供試藥劑的畝（667 m2）用量，是在綜合考慮藥劑推薦用量、活孢子濃度、有效成分含量等因素后確定的。藥劑在移栽時拌土穴施或兌水灌根（見表1）。

表1 各處理編號及處理措施Tab.1 Numbers and measures of treatments

1.3 樣品采集

于煙草成熟期（移栽后120 d），采集試驗小區的各處理根際土壤樣品。采用五點取樣法，每個處理小區隨機選擇5株煙草，挖出完整的根系，輕輕抖去表層土后用細毛刷輕掃附著在根上的土壤，樣品分別標記為HL1、HL2、HL3、HL4、HL5、HL6、HL7。將土壤過2 mm網篩以除去雜物，裝入1 000 mL無菌塑料袋中，一式3份手動混合均勻，24 h內完成運輸，并保存于西南大學微生態過程與調控實驗室2~4℃冰箱中。

1.4 DNA提取、PCR擴增和測序

對于每個土壤樣品，使用FastDNA?SPIN土壤試劑盒（美國MP Biomedicals公司）從0.5 g土壤中提取總DNA。使用ThermoFisher Scientific（美國Multiskan GO公司）酶標儀測量基因組DNA濃度和純度。上游引物515F：5’-GTGCCAGCMGCC GCGGTAA-3’，下游引物806R：5’-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3’；PCR的反應總體積為20 μL。PCR反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環27次；72℃延伸10 min。使用質量分數2%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR產物。標記PCR產物并委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行IlluminaMiSeq測序［10］。

1.5 數據處理

使用QIIME v1.7.0對原始Illuminafastq數據文件進行解復用、質量過濾和分析。操作分類單元OTU（Operational taxonomic unit）選擇具有97%成對同一性的閾值。豐度比較時，使用基于分類法的OTU并通過Origin 9.0軟件進行直方圖分析。

t檢驗（P＜0.05）分析樣本中的差異物種，找到顯著的微生物類群（相對豐度＞1%）。線性判別分析LDA（Linear discriminant analysis）效應大小LEfSe（Linear discriminant analysis effect size）采用Kruskal-Wallis秩和檢驗（α=0.05）來識別類別之間具有顯著差異豐度的分類群，然后使用LDA值估計每個差異豐富特征的效應大小（LDA＞2.0）。

使用SPSS 17.0軟件進行單因素ANOVA方差分析（Analysis of Variance）以及Duncan顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 α多樣性分析

通過對各處理進行OTUs（97%）、Chao指數、Shannon指數、Coverage指數的分析（表2），熒光假單胞桿菌（HL4）與阿維·丁硫（HL6）處理后，OTU數量、物種豐富度、多樣性之間均有顯著性差異。7個處理的Coverage指數（物種覆蓋度）無差異。

表2 不同土壤樣本的細菌α多樣性分析Tab.2 Analysis of bacterial alpha diversity for different soil samples

2.2 物種組成

2.2.1 不同分類水平細菌群落數量分布

在所有樣本中被檢出的4 325個細菌OTU中，分別被分到36個門、89個綱、194個目、371個科、686個屬、1 329個種。

從各分類水平的細菌群落數量來看（表3），淡紫擬青霉（HL3）處理后細菌群落的多樣性更加豐富，阿維·丁硫（HL6）處理后細菌群落的多樣性降低。各處理間的物種OTU數量無明顯變化規律。

表3 各處理不同分類水平細菌群落數量Tab.3 Number of bacterial communities at different classification levels in each treatment （個）

2.2.2 門水平群落組成

在門水平上，各處理中平均相對豐度≥1%的細菌類群共有9個（圖1）。所有土壤樣品中的主要細菌門是變形菌門（Proteobacteria），其次是放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria），它們在各樣本中的平均相對豐度分別為35.13%、23.12%、13.84%、8.97%，在各樣本中共占總豐度約74%（圖1）。

圖1 細菌群落組成（門水平）Fig.1 Bacterial community composition（at phylum level）

2.2.3 屬水平群落組成

在屬水平上，各處理中平均相對豐度≥1%且為已知物種的共有14個（圖2）。鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）在各處理中所占比例最高，其平均相對豐度為5.67%。通過Silva數據庫（http：//www.arb-silva.de）對比，在已知的屬水平上，所占比例依次為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，3.62%~6.81%）、芽 單 胞 菌 屬（Gemmatimonas，2.58%~4.01%）、Pseudarthrobacter（1.53%~9.58%）、Bryobacter（1.44%~3.21%）、根瘤菌屬（Bradyrhizobium，1.60%~2.63%）、Pseudolabrys（1.36%~1.85%）、鏈霉菌屬（Streptomyces，1.52%~2.13%）、Variibacter（1.48%~1.74%）、馬 賽 菌 屬（Massilla，1.60%~1.68%）、Acidibacter（0.51%~1.47%）、芽生球菌屬（Blastococcus，0.62%~1.12%）、克 洛 斯 氏 菌 屬（Crossiella，0.45%~1.19%）、粘液桿菌屬（Mucilaginibacter，0.17%~1.22%）、Chryseolinea（0.16%~1.31%）。

圖2 細菌群落組成（屬水平）Fig.2 Bacterial community composition（at genus level）

2.3 β多樣性分析

β多樣性分析可以用來比較各處理之間微生物群落構成，用于確定各處理間的群落差異關系。在OTU水平，對各樣本進行層級聚類分析，和對照相比，不同處理之間的距離較遠，重復之間距離相近（圖3），可以進一步分析不同群落之間的細菌群落差異。

圖3 各樣本層級聚類分析（OTU水平）Fig.3 Hierarchical cluster analysis of samples（at OTU level）

在OTU水平上將7個處理進行PCoA分析（圖4），不同顏色代表不同處理條件下的樣本組，圖中的箱線圖代表不同組樣本在PC1軸上的分布離散情況。其中淡紫擬青霉（HL3）處理較其他處理離散距離最遠，分布情況最為明顯。表明淡紫擬青霉處理相較于其他處理的細菌群落差異性更大。

圖4 OTU水平上各樣本PCoA分析Fig.4 PCoA analysis at OTU level for each sample

2.4 差異性分析

使用LEfSe分析檢測具有顯著豐度差異的類群，并采用線性判別分析（LDA）來估算每個組分（物種）相對豐度對差異效果影響的大小。在能夠檢測到的屬水平上（排除Norank和Unclassified的類群）各樣本之間LDA值＞2.0的細菌類群中，HL1有9個，HL2有8個，HL3有37個，HL4有9個，HL5有9個，HL6有10個，HL7有10個。各處理LDA值前3名的類群見表4。

表4 不同處理土壤樣本在屬水平上LDA值排序前3位的物種Tab.4 Top three species in LDA value at genus level for soil samples under different treatments

組間差異顯著性檢驗結果表明，在屬水平上（排除Norank和Unclassified的類群），豐度在前10的物種類別及其分別在各樣本中的相對豐度見圖5，分別為：鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、假節桿菌屬（Pseudarthrobacter）、Bryobacter、慢 生 根 瘤 菌 屬（Bradyrhizobium）、Pseudolabrys、鏈霉菌屬（Streptomyces）、Variibacter、馬賽菌屬（Massilia）、芽生球菌屬（Blastococcus）。

圖5 表明，假節桿菌屬（Pseudarthrobacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、馬賽菌屬（Massilia）、芽生球菌屬（Blastococcus）4個屬在各樣本中具有顯著性差異。在各處理中的相對豐度分別如圖6所示。假節桿菌屬（Pseudarthrobacter）、馬賽菌屬（Massilia）在阿維·丁硫處理（HL6）時相對豐度最高，鏈霉菌屬（Streptomyces）、芽生球菌屬（Blastococcus）在哈茨木霉處理（HL5）時相對豐度最高。

圖5 屬水平上各樣本的組間差異顯著性檢驗Fig.5 Significance test of differences between groups of each sample at genus level

圖6 4個屬在各處理中的豐度差異Fig.6 Abundance differences of four genera under each treatment

3 討論

已有研究表明，土壤中添加化學藥劑后細菌群落的物種豐富度和多樣性均顯著下降，且在一定時期內波動幅度較大，細菌群落穩定性降低［11-13］。張保國等［14］和趙靜等［15］研究表明，化學藥劑能夠明顯改變微生物的群落結構和組成，減少微生物的生物量，這與本研究中所發現的化學藥劑阿維·丁硫處理煙草根部，根際土壤中細菌群落的物種數量、豐富度和多樣性明顯降低的結果一致。此外，本研究中發現枯草芽孢桿菌和熒光假單胞桿菌處理后細菌群落的物種豐富度和多樣性顯著提升，且淡紫擬青霉處理也能夠提高物種多樣性。據報道，枯草芽孢桿菌可以提高土壤細菌群落的物種多樣性和豐富度指數，提高群落結構穩定性［16-17］；熒光假單胞桿菌能夠提高土壤微生物功能多樣性［18-20］；淡紫擬青霉也能夠提高根際土壤中細菌群落的物種多樣性［10，21］，且肖順等［22］、劉曉莉［23］、喬月靜［24］均研究表明淡紫擬青霉處理能夠提高根際土壤中真菌和細菌群落的物種多樣性，使得細菌群落結構更加穩定。上述報道均與本研究結果一致。

對優勢細菌類群進行分析發現，各處理間優勢物種的相對豐度差異不大。在門水平，變形菌門（Proteobacteria）是所有土壤樣品中的主要細菌門，其次是放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria）。付琳等［25］發現根際土壤中優勢菌群為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）；趙帆等［26］發現根際土壤中優勢菌種也包含變形菌門（Proteobacteria），放線菌門（Actinobacteria）。以上研究中部分優勢菌群與本研究結果一致。本研究中在屬水平的分析結果表明，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和芽單胞菌屬（Gemmatimonas）是優勢菌屬。這與姚城城等［27］發現果園土壤微生物群落的組成中芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、類似牙球菌屬（Blastocatella）是優勢菌屬的結論基本一致，表明根際土壤中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和芽單胞菌屬（Gemmatimonas）是其優勢菌屬。

不同藥劑處理會對根際土壤細菌群落結構產生較大影響［28-29］。本研究結果表明，田間藥劑處理煙草根結線蟲病后，假節桿菌屬（Pseudarthrobacter）、馬賽菌屬（Massilia）、鏈霉菌屬（Streptomyces）和芽生球菌屬（Blastococcus）在各處理中的相對豐度多組比較具有顯著性差異。其中假節桿菌屬（Pseudarthrobacter）、馬賽菌屬（Massilia）在阿維·丁硫處理后相對豐度最高，鏈霉菌屬（Streptomyces）、芽生球菌屬（Blastococcus）在哈茨木霉處理后相對豐度最高。李苗等［30］、李娟等［31］、楊恩東等［32］對假節桿菌屬（Pseudarthrobacter）和馬賽菌屬（Massilia）進行研究，發現其與土壤性質密切相關。鏈霉菌屬（Streptomyces）作為產生抗生素等生物活性物質種類最多的一類微生物［33-34］，芽生球菌屬（Blastococcus）作為稀有放線菌屬［35-36］，它們在抗逆機制研究、環境修復治理等方面均表現出潛在優勢。以上研究表明，本研究中發現的4種差異菌屬在土傳病害防控和土壤修復調控過程中均有潛在價值。

4 結論

藥劑處理后根際土壤細菌群落結構變化較大，化學藥劑能夠降低細菌群落穩定性，生防菌劑能夠提高細菌群落的物種豐富度和多樣性，其中枯草芽孢桿菌、熒光假單胞桿菌、淡紫擬青霉對根際細菌群落結構穩定的促進效果最為明顯。各藥劑處理對根際土壤細菌組成中優勢物種的影響不大，優勢菌門主要是變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria），平均相對豐度分別為35.13%、23.12%、13.84%、8.97%。優勢菌屬主要是鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和芽單胞菌屬（Gemmatimonas），平均相對豐度分別為5.67%和3.29%。各藥劑處理后根際土壤中假節桿菌屬（Pseudarthrobacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、馬賽菌屬（Massilia）、芽生球菌屬（Blastococcus）的相對豐度都存在顯著性差異。