寧夏西瓜、甜瓜白粉病病原菌鑒定及抗性種質資源篩選

王曉敏，王祿星，宋建宇 ，劉艷 ，高艷明 ，李建設 ，張海英 ，許勇

(1.寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏現代設施園藝工程技術研究中心，寧夏 銀川 750021；3.寧夏優勢特色作物現代分子育種重點實驗室，寧夏 銀川 750021；4.寧夏設施園藝(寧夏大學)技術創新中心，寧夏 銀川 750021；5.北京市農林科學院蔬菜研究中心，北京 100097)

近年來，寧夏西瓜、甜瓜產業栽培總面積超過8.6 萬hm2，但隨著種植面積的擴大，露地及設施甜瓜白粉病危害日益嚴重[1].瓜類白粉病是一種在甜瓜、黃瓜、南瓜、西瓜、西葫蘆等瓜類作物上廣泛發生的世界性病害，已成為瓜類作物綠色生產的主要障礙之一[2-3].該病從苗期到成株均可發病，主要危害葉片，葉柄和莖蔓[2].在發病期白粉病菌呈指數增長且迅速傳播，使植株葉片大面積枯死，導致西瓜、甜瓜產量和品質急劇下降，造成重大的經濟損失[3].危害瓜類白粉病的病原菌主要為蒼耳單囊殼白粉菌Podosphaeraxanthii(原稱Sphaerothecafuliginea，也稱單囊殼白粉菌)和菊科高氏白粉菌Golovinomycecichoracearum(原稱Erysiphecichoraeearum，也稱二孢屬白粉菌)[4].楊靜玲等[5]通過18S rDNA序列分析將中衛壓砂甜瓜的白粉病鑒定到單囊殼屬，李磊福等[6]通過基于ITS序列分析進行分子鑒定，最終確定寧夏溫室內甜瓜白粉病病原菌為單囊殼白粉菌，但未對寧夏其他地區的瓜類白粉病病原菌進行鑒定.引起不同國家和地區甜瓜白粉病的致病菌其主要生理小種有所不同.至今已發現單囊殼白粉菌存在11個生理小種，分別為小種0、1、2U、S、2France、3、4、5、N1、N2、N3和N4，二孢屬白粉菌有2個生理小種，分別為Race I和Race II[7-8].

自1981年以來，我國西瓜、甜瓜病理及育種工作者先后在浙江[9-11]、北京[12]、黑龍江[13-15]、海南[16]、甘肅[17-18]、陜西[19-20]、上海[11，21-22]、吉林[23]、河南[24]、新疆[2,4,25]等地開展了西瓜、甜瓜主產區的白粉病菌及其生理小種的鑒別工作，基本明確了我國西瓜、甜瓜白粉病均由P．xanthii引起，主要生理小種至少有2個，分別為生理小種1和2France，由于我國氣候類型復雜，栽培模式多樣，種植品種繁多，造成了不同地區的優勢生理小種不同[10].因此，全面了解我國瓜類白粉病菌的生理小種分布還需要一定的時間和過程.尤其對寧夏地區西瓜、甜瓜白粉病生理小種鑒定尚沒有全面詳細的報道.所以明確寧夏地區西瓜、甜瓜白粉病菌的生理小種對于引進抗源材料、開展抗病育種及白粉病防治方面均具有重要意義.本研究擬通過病原菌形態學和ITS-rDNA序列、國際通用瓜類白粉病鑒別寄主對西瓜、甜瓜白粉病病原菌進行鑒定及生理小種鑒定，以期明確引起寧夏地區西瓜、甜瓜白粉病的病原菌種屬、生理小種的分化、優勢生理小種，并對寧夏地區23份甜瓜種質資源進行離體葉片法抗病性鑒定，為有效開展西瓜、甜瓜白粉病防治與抗白粉病育種提供依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 西瓜、甜瓜白粉病病原樣本 2019年6月-8月分別從寧夏銀川、中衛、中寧、彭陽、隆德、涇源、青銅峽、平羅、鹽池、吳忠、海原等11個地區西瓜、甜瓜自然發病的病株上采集白粉病病葉，并于盡快接種在感病甜瓜上進行分離純化后的白粉病菌作為病原樣本(詳細信息見表1).

表1 寧夏地區西瓜、甜瓜白粉病病原樣本采集信息

1.1.2 感病甜瓜品種 用于白粉病病原菌分離、純化與擴繁的感病甜瓜品種為“中原新羊角蜜”.

1.1.3 鑒別寄主 國際通用的瓜類白粉病生理小種鑒定的一整套13個甜瓜鑒別寄主Iran H、Topmark、Vedrantais、PMR 45、PMR 5、WMR 29、Edisto 47、PI 414723、MR 1、PI124111、PI124112、PMR 6和Nantais Oblong，均由北京市農林科學院蔬菜研究中心提供.所有寄主材料在銀川嚴格套袋自交擴繁.

1.2 試驗方法

1.2.1 白粉病病原菌的分離純化與擴繁 將采集的不同地區的病葉樣本先用無菌水洗掉表面灰塵，制成約1×105個/mL孢子懸浮液，用摩擦法接種到寧夏大學農科實訓基地溫室內盆栽種植的中原新羊角蜜甜瓜葉片上，將其放置在溫室內搭建的小棚中進行擴繁保存，每個小棚中只培養一個地區的白粉病菌，嚴格分離，避免交叉污染.詳見王祿星等[1]的方法.

1.2.2 白粉病病原菌的鑒定

1.2.2.1 孢子形態觀察 1)分生孢子觀察：用挑針挑取純化后發病葉片上白粉病病原菌的分生孢子，采用無菌水懸浮，制作臨時玻片，每個地區的白粉病菌制作5個玻片，每個玻片在光學顯微鏡下選取5個視野，每個視野觀察10個孢子，用顯微測微尺測量分生孢子長度和寬度，并記錄分生孢子著生狀態及形狀.參照李金鴻等[26]的方法.2)萌發管觀察：首先將2%瓊脂水溶液滴至載玻片上，放在下面墊有雙層濕潤濾紙的培養皿內，然后用挑針挑取少量白粉菌分生孢子于瓊脂液面，置于25 ℃的恒溫箱中培養48 h后取出，顯微鏡下觀察芽管萌發，每個地區的白粉病菌分別觀察5個玻片，每個玻片各選取5個視野，每個視野觀察5個萌發孢子，顯微測微尺測量萌發管長度和寬度，并記錄萌發管著生位置.

1.2.2.2 纖維狀體觀察 用挑針挑取少許病原菌分生孢子于載玻片上的3% KOH液滴中，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察分生孢子是否有纖維狀體，每個地區的白粉病菌分別觀察5個玻片，每個玻片觀察5個視野，每個視野至少取10個分生孢子.

1.2.2.3 瓠瓜接種試驗 將上述11份甜瓜白粉病菌的分生孢子配制成濃度為1×105個/mL的孢子懸浮液，通過刷葉法接種于二葉期瓠瓜上，每個地區材料接種5株，接種后置于盛有蒸餾水的塑料桶保濕暗培養24 h，取出放在溫度為20～25 ℃溫室內，7～9 d后調查侵染情況，詳見張艷菊等[27]的方法.

1.2.3 白粉病菌的 ITS序列比對和系統發育分析 用干凈的軟毛刷從新鮮繁殖的甜瓜葉片表面刷下白粉病菌分生孢子，將其收集于1.2 mL離心管中，按照Biospin真菌提取方法進行DNA的提取，對獲得的白粉病菌基因組DNA進行檢測，檢測合格的DNA樣品于-20 ℃儲存.采用真菌核糖體通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增.PCR反應體系見表3，PCR反應程序見表4.PCR擴增產物或酶切反應產物均于1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測.將檢測之后的基因組DNA樣品送往上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序.登錄NCBI，blastn對DNA序列進行比對分析，并選擇部分比對結果通過MEGA-X軟件對其進行聚類分析.

表2 PCR反應體系信息表

表3 PCR反應程序表

1.2.4 白粉病病原菌的生理小種鑒定

1.2.4.1 鑒別寄主準備 將13個鑒別寄主種子催芽后播種于口徑20 cm的育苗缽內，每個苗缽內播種8粒同一個品種，每個品種種植15個苗缽，出苗后選取11份長勢較好的苗缽分組，每組包括13個鑒別寄主，一組苗置于一個小棚內，并用塑料薄膜與其他組隔離，避免交叉污染.詳見張波等[23]的方法.

1.2.4.2 鑒別寄主接種鑒定 于鑒別寄主子葉展平期采用孢子懸浮液摩擦法接種，詳見1.2.1，接種5～7 d開始發病，20 d充分發病后開始調查鑒別寄主的抗感反應，病情分級標準參照王娟等[12]的方法.

將病情分為 6 級：0 級：整個植株沒有病斑；1 級：僅子葉有很少量病斑；2 級：僅子葉有較多病斑或子葉有病斑，莖上有很少量病斑；3 級：子葉有很多病斑，莖上有少量病斑；4 級：子葉和莖上布滿病斑或真葉有病斑；5 級：植株因感病而死.

計算病情指數(DI).DI=100×∑(病級級數×發病株數)/(5×總株數).

抗病：0

表4 甜瓜白粉病菌生理小種鑒別寄主及其抗感反應[13]

1.2.5 23份甜瓜種質資源的離體葉片抗病性鑒定 采用滅菌后的打孔器將23份甜瓜種質資源(表9)的第3～4片葉打成1.5 cm葉碟，每個平板培養基上培養5片葉碟，用移液槍將濃度約為1×105個/mL的白粉菌分生孢子懸浮液接種在葉片正面中心，每份種質資源接種3個培養基，放入培養箱，白天 25 ℃，晚上 20 ℃、濕度 70%、12 h 光暗交替的條件下培養.接種 7 d 后開始觀察記錄，在15～20 d充分發病后調查發病率和病情指數.離體葉片法病情分級標準參考鄧麗君[25]的方法，詳見表5.計算病情指數(DI).DI=100×∑(病級級數×發病葉數)/(4×總葉數).根據病情指數，對23份甜瓜種質資源進行抗感分級，詳見表6.

表5 離體葉片抗病性鑒定方法病情分級標準

表6 甜瓜白粉病抗感分級標準

2 結果與分析

2.1 寧夏不同地區瓜類白粉病病原菌鑒定

2.1.1 瓜類白粉病病原菌孢子形態觀察 通過對寧夏11個地區的瓜類白粉病病原菌分生孢子形態觀察發現(圖1，表7)，分生孢子橢圓形，無色，串生(圖1-A)，分生孢子長寬范圍在(25.25～38.25)μm×(14.50～22.00)μm，長寬比為1.26～2.41.分生孢子內有明顯的纖維狀體，纖維狀體盤狀、新月形(圖1-B).分生孢子萌發時，芽管從分生孢子側面長出(圖1-C)，芽管的長度變化范圍較大(16.00～46.25 μm)，寬度變化范圍相對較小(5.00～15.75 μm)，并沒有觀察到白粉病病原菌分生孢子有性狀態.通過分生孢子形狀、大小、萌發管長寬、萌發管側生以及孢子內部含有發達的纖維狀體等特征，初步鑒定引起寧夏11個地區的西、甜瓜白粉病的病原菌是蒼耳單囊殼白粉菌(Podosphaeraxanthii).

圖1 分生孢子形態特征觀察(400×)

表7 寧夏不同地區白粉病病原菌分生孢子形態特征比較

2.1.2 瓠瓜接種試驗 11個地區甜瓜白粉病菌接種瓠瓜后，7 d后開始出現白粉病，10 d后表現明顯癥狀(圖2)，說明11個地區的甜瓜白粉病菌均能侵染瓠瓜.因此可以確定引起寧夏11個地區的甜瓜白粉病病原菌為蒼耳單囊殼白粉菌(Podosphaeraxanthii).

圖2 瓠瓜接種白粉病菌10 d的葉部癥狀

2.2 寧夏不同地區瓜類白粉病病原菌ITS序列分析

擴增得到寧夏地區瓜類白粉病菌ITS序列片段長度約570 bp(圖3).將寧夏地區瓜類白粉病病原菌rDNA-ITS序列命名為n1.選擇部分BLAST比對結果，構建系統發育樹(圖4)，n1與蒼耳單囊殼白粉菌Podosphaeraxanthii的ITS序列聚為一類，同源性為100%，判定寧夏地區甜瓜上的白粉病菌為蒼耳單囊殼白粉菌Podosphaeraxanthii.

圖3 寧夏地區西瓜、甜瓜白粉病菌ITS序列擴增電泳圖

圖4 基于ITS rDNA序列分析的系統發育樹

2.3 寧夏不同地區瓜類白粉病病原菌生理小種鑒定

如表8所示，寧夏11個地區白粉病病原菌對Iran H，Topmark，Vedrantais，Nantais Oblong等4個鑒別寄主均表現為感病，而對鑒別寄主PMR45，PMR5，WMR29，Edisto47，PI414723，MR1，PI124111，PI124112，PMR6雖產生了不同程度的病斑，但病斑未見擴展，且均表現為抗病，與表4中瓜蒼耳單囊殼白粉菌生理小種 1的抗感反應表現一致.因此，可以確定此次調查的寧夏11個西瓜、甜瓜主要栽培區的白粉病病原菌生理小種均是蒼耳單囊殼白粉菌的生理小種1，未發現其他生理小種.

表8 寧夏地區西瓜、甜瓜白粉病生理小種鑒定結果

2.4 23份甜瓜種質資源離體葉盤白粉病抗病性鑒定

利用離體葉片抗病性鑒定方法對甜瓜23份種質資源的白粉病抗病性進行鑒定.如表9所示，1489發病率與病情指數均為零，表現為免疫(IM)；1464、Sweet、抗病F-3800表現為高抗(HR)，發病率低于40%，病情指數低于10；玉露、美玉25號、綠洲紅表現為中抗(MR)；天蜜、ND-1、新密45號表現為抗病(R)；15TZH-16表現為感病(S)；日本蘭網、15TZH-23、15TZH-25、15TZH-39、15TZH-46、15T38、NT-1、TZH-26表現為中感(MS)；15TZH-24、15T41、中原新羊角蜜、15TZH-01表現為高感(HS)，接種15 d后，高感品種的發病率均高于90%，從發病程度上看，15TZH-24>15T41>中原新羊角蜜>15TZH-01.抗病類型一致的種質資源材料之間的病情指數無顯著性差異.

表9 離體葉片抗病性鑒定方法對甜瓜種質資源的白粉病抗病性鑒定(20 d)

3 討論

明確瓜類白粉病菌種屬對抗病育種至關重要.目前，國內有關甜瓜白粉病病原菌鑒定結果均表明我國甜瓜白粉病是P．xanthii所致，不存在其他種.本研究對寧夏11個地區的白粉病樣品分類鑒定，符合屈淑平等[28]對蒼耳單囊殼白粉菌的形態描述，分生孢子呈廣橢圓形，內含纖維狀體.初步確定寧夏地區瓜類白粉病的病原菌為蒼耳單囊殼白粉菌.但是白粉菌的種類繁多，個體多態性明顯，且其生長、生理生化特征可能隨著環境的變化而不穩定.因此，再進一步采用瓠瓜接種試驗，張艷菊等[27]認為只有單囊殼白粉菌能侵染在瓠瓜上，由此進一步明確寧夏地區瓜類白粉病為蒼耳單囊殼白粉菌.再利用真核生物內核糖體rDNA的ITS序列對甜瓜白粉病菌進行分子鑒定，最終明確了寧夏地區西瓜、甜瓜白粉病均為蒼耳單囊殼白粉菌P.xanthii，這與先前楊靜玲等[5]和李磊福等[6]對于寧夏中部干旱帶壓砂甜瓜和寧夏溫室甜瓜白粉病病原菌的鑒定結果一致.

本研究首次通過國際通用的標準鑒定體系對寧夏地區西瓜、甜瓜白粉菌生理小種進行了研究，結果表明寧夏地區白粉菌生理小種均為蒼耳單囊殼白粉菌的生理小種1.西瓜、甜瓜白粉病生理小種分化復雜，我國已有不少學者對不同地區的甜瓜白粉病生理小種進行了研究.在北京[12]、黑龍江[13-15]、海南[16]、甘肅[17-18]、上海[21]、吉林[23]和新疆[24-25]地區均存在單囊殼白粉菌小種1，但其中北京、海南和吉林地區以2France為優勢生理小種，浙江地區主要病原菌由生理小種2引起的[9]，黑龍江還存在生理小種N1和新生理小種[15]，甘肅也發現存在生理小種7[17].生理小種的快速分化導致新的生理小種很快演替變成優勢生理小種，導致抗性材料難以維持對白粉病持久抗性，同時也導致不同地區優勢生理小種的不同.因此，今后還需要對寧夏地區西瓜、甜瓜白粉病菌生理小種進行長期監測，明確整個寧夏地區瓜類白粉病的種類及生理小種，為整個寧夏地區的瓜類作物生產、種子繁育及白粉病抗病育種奠定基礎.

預防甜瓜白粉病最有效的方法是選育抗病品種，本研究采用離體葉片鑒定方法對寧夏地區23份種質資源進行抗病性鑒定，結果表明，1489、1464、Sweet、玉露、天蜜、ND-1、日本蘭網、15TZH-23、15TZH-39、15TZH-46、15T38、NT-1、TZH-2615T41、中原新羊角蜜、15TZH-01與室內苗期抗病性鑒定方法的鑒定結果一致[1].抗病F-3800、美玉25號、綠洲紅、新密45號比室內苗期抗病性鑒定方法的鑒定結果抗病性高了一個檔.15TZH-24室內苗期抗病性鑒定結果是感病(S)，而離體葉片鑒定結果是高感(HS)，高了2個檔.15TZH-16、15TZH-25離體葉片鑒定方法的鑒定結果比室內苗期抗病性鑒定結果低了一個檔.兩種抗病性鑒定方法的病情指數一致的有16份，占69.57%，7份種質資源抗感類型不一致，可能是由于兩種鑒定方法之間的誤差導致.離體葉片抗病性鑒定方法發病速率快，菌種用量少，環境因素可控，但葉片易被污染，控制好無菌條件的前提下，適用于大量材料的鑒定[27-28].因此用離體葉片接種鑒定甜瓜品種的抗病性是可靠的.篩選出免疫材料1份(1489)，高抗材料3份(1464、Sweet、抗病F-3800).此研究結果為有效防治寧夏甜瓜白粉病和抗白粉病新品種的選育奠定基礎.

4 結論

本文明確了引起寧夏地區西瓜、甜瓜白粉病的病原菌為蒼耳單囊殼白粉菌(Podosphaeraxanthii)，且其優勢生理小種為小種1.結果具有一定的代表性，為有效的抗病育種提供科學依據.