低磷脅迫下小麥根系形態特征及Apase活性

王樹鵬，汪軍成，姚立蓉，孟亞雄，李葆春，楊軻，司二靜，王化俊，馬小樂，尚勛武

(1.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州 730070)

磷素參與植物的多種代謝途徑，對植物的生長發育非常重要[1].而我國60%以上的耕地土壤嚴重缺磷，通常是通過增施磷肥來緩解這一現狀.但是能夠被作物吸收和利用的磷素有限[2]，大部分被Ca2+、Fe3+、Mn2+等金屬離子固定在土壤中[3]，從而造成土壤酸堿失衡和生態污染.另外，農業生產所用磷肥為不可再生資源，隨著農業對磷肥需求量的不斷增加，磷礦將在未來50～200 a面臨枯竭[4].為了應對未來磷礦枯竭對農業生產帶來的危機，減少農業生產中磷素施用尤為重要，因此研究作物的磷脅迫響應機制、篩選耐低磷品種并挖掘磷素高效轉用基因及培育耐低磷品種迫在眉睫.

作物在低磷脅迫下的生長會出現各種形態和生理上的適應特征，例如總根長和表面積降低，同時一級側根的密度和數量增加，細根比例升高和根系平均直徑降低等[5-6]，使根系能夠獲取與土地更大的接觸面積，以擴大對磷素的吸收范圍.隨著磷素脅迫時間的延長，春小麥根系酸性磷酸酶(acid phosphatase activity，Apase)活性不斷升高，有利于植物對于磷素的分解與吸收.張麗梅等[7]通過研究玉米根系，發現低磷促使根系較對照變長變細，并隨著脅迫時間的延長，根干質量和根冠比相對增加，低磷脅迫也會促使酸性磷酸酶的增加；陳雯彬等[8]通過改變低磷脅迫的濃度，發現赤皮青岡幼苗的總生物量不斷減少，以適應低磷脅迫及減少磷素消耗.

目前對于春小麥的研究多集中在耐低磷種質資源基因的篩選與評價中，而有關磷素對小麥根系發育及Apase響應的研究相對比較少.本研究以3個不同耐低磷特性的春小麥品種為材料，在正常磷和低磷脅迫2個處理下，通過水培試驗測定春小麥根系的形態指標和Apase活性的變化，探究磷素脅迫對不同耐低磷小麥品種苗期根系生長的影響，為進一步挖掘春小麥耐低磷關鍵基因和培育耐低磷春小麥新品種奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用3個不同春小麥品種為試驗材料，其中wp-35、wp-72為耐低磷品種，wp-119為磷敏感品種[9].該供試材料由甘肅農業大學農學院麥類遺傳育種實驗室提供.

1.2 試驗設計

水培試驗在人工氣候室進行，選取籽粒飽滿、大小一致的種子，用5%NaClO溶液消毒5 min，用蒸餾水沖洗3次，然后將種子放入鋪有兩層濾紙的培養皿中，5 d后挑選長勢一致的幼苗，移栽到裝有1/2 Hoagland營養液的水培箱，每盆24株，進行正常磷處理(0.2 mmol/L，CK)和低磷脅迫處理(0.02 mmol/L，-P)，3次重復，以KH2PO4為磷源，同時在低磷脅迫的營養液中加入0.18 mmol/L的KCl補足K元素，pH為 6.8±0.1，其余營養液[10]成分均相同.從脅迫處理開始計為0 d，并在脅迫3、7、14、21、30 d時選取不同處理環境下有代表性的小麥幼苗進行數據測定.

1.3 測定指標及方法

根系形態掃描：采用根系掃描儀(Epson，Long Beach，CA，USA)和WinRHIZO軟件(Quebec，QC，CAN)計算根系相關指標[11]，并測量地上部與根系的干質量，計算根冠比.

根冠比=根鮮質量(干質量)/地上部鮮質量(干質量)

酸性磷酸酶(Apase)活性的測定：參照劉淵等[12]方法測定根組織中Apase活性，Apase活性以單位時間內單位質量的根和葉生成的對硝基苯酚(PNP)的量來表示(μmol/(g·min)).Apase活性先進行酶液的提取，之后加入酶標板在酶標儀中進行測定.

1.4 數據處理

使用Microsoft Excel 2010和GraphPad Prism 6.01分析作圖，采用SPSS 19.0對數據進行分析.

2 結果與分析

2.1 低磷脅迫對春小麥根系形態的影響

通過苗期水培試驗，研究了春小麥耐低磷品種(wp-35、wp-72)和磷敏感品種(wp-119)在正常磷和低磷條件下根系形態特征的變化.如表1所示，小麥根系的生長發育均受低磷脅迫的影響，但低磷脅迫處理下不同耐低磷小麥的響應程度不同.耐低磷品種wp-35和wp-72在低磷脅迫處理3 d和7 d時，與對照相比根系形態無顯著性差異，在低磷脅迫21 d時，wp-72的總根長較對照增加了27.25%，達到顯著差異；在低磷脅迫30 d時，除wp-72的根體積達到顯著增長外，耐低磷品種wp-35和wp-72的其他根系性狀并未形成顯著性差異；而磷敏感品種wp-119的總根長、根表面積和根體積在低磷脅迫14、21、30 d時，與對照相比均達到了顯著性升高的變化.

表1 不同磷效率基因型在不同磷水平下根系形態指標的變化

2.2 低磷脅迫對春小麥苗期生物量的影響

低磷脅迫對小麥的地上部和根系生長均有較大影響.由圖1可以看出，低磷脅迫抑制小麥的地上部生長，耐低磷品種wp-35和wp-72在低磷脅迫30 d時與對照相比分別下降11.39%、10.57%，無顯著差異；而磷敏感品種wp-119與對照相比下降達26.16%，并且在脅迫21 d和30 d時與對照相比均達到顯著性差異.就根系干質量來看，低磷脅迫促進小麥根系的生長，耐低磷品種wp-35和wp-72的根系隨著脅迫程度加深，根系干質量呈增長趨勢，并且耐低磷品種wp-72的根系增幅更高，且在脅迫處理30 d時達到顯著性差異；而磷敏感品種wp-119在脅迫處理14 d和21 d時與對照相比均達到了顯著性差異；在處理30 d時，其根系受到了明顯的抑制作用.就整株生物量而言，低磷脅迫抑制作物的生長，總體呈下降趨勢，耐低磷品種wp-35和wp-72的降幅小于磷敏感品種wp-119，且wp-119在低磷處理30 d時與對照相比達到顯著性差異，降幅達到22.22%.

圖1 磷脅迫對春小麥苗期生物量的影響

對低磷脅迫下春小麥苗期的根冠比進行計算并分析，結果見表2.由表2可以看出，不同耐低磷小麥根冠比在低磷脅迫下與對照相比均升高，說明磷素脅迫有利于提高小麥苗期的根冠比.耐低磷品種wp-35和wp-72在低磷脅迫3、7、14和21 d時增幅較小，脅迫處理30 d時2個處理間的增幅分別為15.42%、30.59%，均達到了顯著性差異；磷敏感品種wp-119在低磷脅迫14、21和30 d時與對照相比均達到顯著性提高，其增幅分別為75.69%、92.06%和40.22%，但是其根冠比的各項值均低于耐低磷品種.低磷處理14、21和30 d時小麥根冠比在磷水平和不同基因型間均存在極顯著差異，在低磷處理14 d和21 d時存在極顯著的磷水平×基因型交互作用.

表2 磷脅迫對春小麥苗期根冠比變化

2.3 低磷脅迫對春小麥根系組織中Apase活性的影響

對磷脅迫下春小麥根系Apase的活性進行測定并分析，由表3可以看出，隨著脅迫程度的增加，小麥根系Apase活性不斷升高.在相同磷水平下(CK和-P)，耐低磷品種wp-35和wp-72的Apase活性(除3d時)均高于磷敏感品種wp-119；在低磷脅迫21 d和30 d時，耐低磷品種wp-35、wp-72和磷敏感品種wp-119的Apase活性與對照相比均達到顯著性提高，增幅分別為18.80%、49.19%、26.94%和51.53%、46.19%、92.30%；wp-119的Apase活性在30 d時增幅高是因為該品種在該時期正CK下的Apase活性較21 d時的CK無顯著提高，而30 d時的低磷脅迫下Apase活性又顯著提高所致，但30 d時Apase活性的仍舊低于耐低磷品種wp-35和wp-72，小麥根系Apase的活性參數(除低磷處理21 d外)在磷水平上均有顯著差異，在不同基因型之間存在極顯著差異，在處理3、7 d時，磷水平×基因型存在極顯著的交互作用，而Apase活性中的基因型在所有階段都呈現極顯著差異，故而Apase活性主要由基因型調控.

表3 不同磷水平對不同基因型小麥根系酸性磷酸酶活性的影響

2.4 施磷水平和基因型差異對小麥根系形態變異的影響

采用主成分分析法研究施磷水平和基因型的差異，對小麥根系形態變異的總效應，對 7個形態參數指標進行主成分的提取(表4)，如總根長、總根表面積、總根體積等.由表4可以看出，提取的前2個主成分累積貢獻率為78.62%，對數據組的總變異有較高的解釋，其中，主成分1(PC1)解釋了55.39%的變異，其中總根表面積、總根體積、干質量、根冠比以及Apase活性的權重系數(表4)較高，表明不同的基因型對根干質量、根系總參數及Apase活性均有顯著影響；主成分2(PC2)解釋了23.23%的變異，其中總根長和地上部干質量的載荷值較高，說明地上部生物量受磷水平的影響較大.

表4 主成分載荷矩陣

3 討論

植物根系的生長發育主要受其遺傳因素和外部環境等因素的影響，具有較大的可塑性.外界營養元素的有效性與分布特點是影響根系構型的重要因子之一[14].有研究表明，根系是植物主要的同化、轉化與合成器官，植物可通過其形態特征適應環境的變化擴大活動范圍，增加對磷素的吸收和利用[15].同類作物在受到低磷脅迫時，不同品種的適應性和磷素的利用效率有顯著差異[16-17]，磷高效小麥品種具有更高的磷素利用效率以及較好的根系農藝性狀等參數.本研究顯示，在脅迫處理30 d時，耐低磷品種的總根長、總根表面積和總根體積均顯著高于磷敏感品種.說明由于品種的差異，耐低磷品種的根系適應性更有利于作物的生長，同時苗期對磷素的吸收更有利，但其對營養成分的利用效率的差異還需要進一步的研究與證實.在低磷脅迫的情況下，磷敏感品種wp-119的根的總長、表面積和體積相比對照增幅達到最大，但隨著磷素脅迫的延長，適應調節能力的逐漸削弱；而耐低磷品種wp-35和wp-72在低磷脅迫的初期的適應性相對穩定，其適應調節主要表現為脅迫后期，產生差異可能是由于不同的基因型小麥根系中磷素的利用效率和生理活性的物質代謝強度等因素，其機理還需要進一步研究.

根冠比反映了植物的地上和下部與植物生長的相關性.低磷脅迫植物的根冠比增加，是一種耐低磷脅迫機制.目前有兩種不同的觀點：植物主動調節機制和被動機制[18].本研究的結果顯示，不同的磷脅迫對小麥根系有顯著影響，低磷脅迫能誘導出苗期總根的長度，根表面積和根體積顯著增加，從而使小麥根冠比上升，發現是小麥主動調節根系形態，以提高對營養成分的吸收，這與第一種觀點比較相似.

低磷脅迫對植物細胞內的Apase活性起誘導作用，有研究推測它的生理意義可能是APase通過增加植物體內有機磷化合物的水解，促進體內磷源的再吸收利用，提高磷素的利用效率[19].如耐低磷基因型小麥小偃54在低磷脅迫下可以通過提高根系Apase活性來增加對外界磷素的吸收.本研究發現，從低磷脅迫處理下14 d開始，小麥根系組織的Apase活性開始升高，且耐低磷品種wp-35和wp-72的Apase活性在每一測定時期均高于磷敏感品種wp-119，可以推測出耐低磷品種對其體內有機化合物中磷的分解和再利用效率高于磷敏感品種，表明低磷脅迫對于不同品種的小麥，根系酶活性具有不同的調控作用，耐低磷品種和磷敏感性品種在低磷脅迫處理下的響應有一定的差異，因而其體內磷素的再利用能力也有所不同.同時本研究與煙草[20]和玉米[21]等有關Apase活性研究結果相一致.

低磷脅迫影響植物生長中的多個表型，主成分分析是通過少數幾個主成分來分析表明多個變量之間的內部聯系，唐榮莉等[22]研究表明，對低磷脅迫下的辣椒測定主成分分析發現根冠比增加，從而增大對磷素的利用效率，成為篩選辣椒不同品種的重要參數；李鋒等[23]通過對低磷脅迫下的不同基因型小麥進行主成分分析發現，故根冠比作為區別兩種不同基因型小麥的依據.本研究提取了兩個主成分，通過對根冠比、總根長、總根表面積、總根體積等幾個因素的分析區別對于低磷脅迫下不同基因型小麥的生長趨勢，主成分1中最大載荷值為根冠比(0.937)，主成分2中最大載荷值為地上部干質量(0.798)，且主成分1的特征值和貢獻率大于主成分2，因此根冠比可首選作為區分不同基因型小麥品種的重要參數.這一結果與辣椒[22]和小麥[23]結論一致.

4 結論

在不同的施加磷素的水平下，小麥的總根的長度、表面積、體積和根冠比都是磷效率基因型表現最顯著差異的指標，也是影響小麥磷素吸收的重要指標之一.在低磷脅迫下，耐低磷基因型小麥可通過在保證植株正常生長的情況下，增加體內Apase活性，提高磷素的再利用并調節根系構型，減少單位根長構建所消耗的生物量，增加小麥根部伸展和磷素的吸收能力.因此，平衡地上部和地下部的生長，是耐低磷基因型小麥適應低磷脅迫的基礎.根冠比作為區別不同基因型小麥品種的重要參數.