甘肅省慶陽市辣椒鐮孢菌根腐病病原鑒定及生物學特性

連蕓蕓，李煥宇，李惠霞，姜偉，李金鴻，石明明，韓變

(甘肅農業大學植物保護學院，甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

辣椒(CapsicumannuumL.)是茄科辣椒屬植物，原產于中拉丁美洲熱帶地區，現于世界各國普遍種植[1-2]，既可作調料、蔬菜和觀賞植物，還可用作藥物、天然色素、化妝品和驅蟲劑活性成份的提取原料[3].辣椒根腐病是一種常見的土傳病害[4]，在國外已有報道[5]，國內自20世紀50年代俞大紱首次報道以來[6]，現已遍及全國.已報道的辣椒根腐病致病菌有鐮孢屬[7]、疫霉屬[8]和腐霉屬[9]等，其中鐮孢菌是引起辣椒根腐病的主要病原菌.由鐮孢菌引起的辣椒根腐病發生周期長，在幼苗期及生長期均能發生，主要侵染辣椒根及根莖部，導致辣椒減產造成嚴重的經濟損失.鐮孢菌產生的毒素等次生代謝產物可引起人畜中毒，嚴重時甚至造成死亡[10].郝蓉蓉等[11]發現引起西藏地區辣椒根腐病的鐮孢菌是尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)，蔡高磊等[12]報道了湖北省十堰市的辣椒根腐病是由茄鐮孢菌(F.solani)引起的，黃建都等[13]認為茄鐮孢菌(F.solani)是福州地區辣椒根腐病的致病菌，但對甘肅省慶陽市辣椒根腐病菌的研究尚未見報道.

本試驗以慶陽地區辣椒根腐病2株代表性菌株67R5c和68R5b為材料，通過致病性測定、基于形態學和翻譯延伸因子TEF-1α基因序列分析病原菌種類，并測定其生物學特性，為明確其病原菌組成和該病害的有效防治提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：菌株67R5c和68R5b保存于甘肅農業大學植物保護學院植物病原真菌學實驗室.

供試培養基：PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，自來水1 L；WA培養基：瓊脂粉20 g，自來水1 L；CLA培養基：瓊脂粉20 g，自來水1 L，培養皿在倒入培養基前加入10～12片無菌康乃馨葉片(3～5 mm2)；查氏培養基：NaNO32.0 g，KCl 0.5 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO40.01 g，蔗糖30 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 L.

以上4種培養基在121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min后備用.

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌純化 供試病原菌在PDA培養基上活化后，按常規方法在WA平板上單孢純化[14]，純化菌株保存于4 ℃冰箱備用.

1.2.2 病原菌致病性測定 采用改良平皿法[15]測定供試菌的致病性.將直徑5 mm菌餅接于WA培養基小燒杯中，蓋上滅菌鋁箔培養3 d.將發芽的辣椒種子均勻插入菌餅周圍，置于25 ℃光照培養箱中恒溫培養15 d后觀察發病情況.以相同條件下培養的辣椒為對照.試驗重復3次，每重復15株.

1.2.3 形態學鑒定 菌株接種于PDA培養基后，置于25 ℃培養箱中培養，5 d后觀察菌落性狀.菌株接種CLA培養基后，于25 ℃人工智能培養箱內12 h，光照/黑暗交替培養，14 d后觀察形態特征，并拍照記錄.根據菌株形態特征進行病原鑒定[16-18].

1.2.4 分子生物學鑒定 將菌株接種于PD培養液后，在(25±0.5)℃ 120 r/min搖床中振蕩培養7 d，過濾菌液獲得菌絲.取新鮮菌絲100 mg，加入液氮后充分研磨后轉移至1.5 mL無菌離心管中，用試劑盒E.Z.N.A.TMHP Fugal DNA Kit(OMEGA)提取基因組DNA，用引物EF1(5′-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3′)和EF2(5′-GGARGTACCAGTSATCATG-3′)進行PCR擴增[19].擴增體系為25.0 μL：DNA模板1.0 μL、Taq酶0.25 μL、上下游引物各1.0 μL(10 μmol/L)、10×Buffer(Mg+)2.5 μL、dNTP(10 mM)0.5 μL，ddH2O 18.75 μL.PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行34個循環，72 ℃終延伸10 min.

電泳檢測PCR產物后，將有特異性條帶的PCR擴增樣品送至北京擎科生物科技有限公司西安分公司測序.將獲得的序列校對拼接后，在GenBank中進行BLAST搜索并下載相似度較高的序列，經序列比對后用PAUP軟件以最大簡約法(MP)構建系統發育樹.

1.2.5 病原菌生物學特性研究

1.2.5.1 不同培養溫度、光照條件對病原菌生長和產孢的影響 以查氏培養基為基礎培養基，接種后分別放置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃培養箱中培養；放置于全光照、全黑暗、光暗交替(各12 h)的培養箱中25 ℃暗培養.每處理3次重復.病原菌培養5 d后，用十字交叉法測量菌落直徑，培養12 d時，以每皿5 mL 0.1%吐溫洗脫孢子，采用血球計數板法測量病原菌產孢量.

1.2.5.2 不同碳、氮源對病原菌生長和產孢的影響 稱取與蔗糖等量的葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和淀粉制成Czapek培養基，以不加碳的為對照培養基.選用與硝酸鈉等量的硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、硝酸鉀和硝酸銨制成Czapek培養基，以不加氮的為對照培養基.將病原菌接種于不同碳氮源培養基后，25 ℃暗培養.每處理重復3次.測定菌落直徑和產孢量同1.2.5.1.

1.3 數據處理

所得數據用Excel 2010進行整理，用SPSS 22.0進行差異顯著性統計分析.

2 結果與分析

2.1 供試菌株的致病性

辣椒種子接種供試病原菌15 d后的發病情況如圖1所示.對照辣椒幼苗健康不發病，根部無任何癥狀.接種菌株68R5b的辣椒苗莖基部及根部有黑色或褐色病斑，后期呈水漬狀，辣椒葉片有萎蔫癥狀.接種菌株67R5c的辣椒幼苗莖基部有黑色或褐色病斑，病斑面積小，后期呈水漬狀.表明2個菌株均能侵染辣椒根部及莖基部，引起辣椒根腐，菌株68R5b致病力強于菌株67R5c.

A:對照;B:接種菌株為68R5b;C:接種菌株為67R5c.

2.2 病原形態特征

菌株68R5b在PDA平板上生長較快，菌落平展，邊緣圓形，菌絲較稠密，菌落正反面淺紫色，菌絲稀疏呈卷毛狀；產孢細胞結構為單瓶梗；大孢子數目多，1～6隔，大小為(16.1～39.7)μm×(3.5～6.3)μm，紡錘形，基胞足跟較尖，呈鉤狀；小孢子0～1隔，大小為(5.4～14.8)μm×(2.8～5.2)μm，橢圓形或卵形或腎形；厚垣孢子單生或串生，壁光滑(圖2).

A:菌落性狀;B:分生孢子;C:分生孢子梗;D:厚垣孢子.

菌株67R5c在PDA平板上生長快，菌落平展，邊緣為毛狀，菌落正反面為白色或灰白色，菌絲稠密呈絮狀；產孢結構為單瓶梗；大孢子數目多，1～5隔，大小為(16.9～30.0)μm×(3.3～5.5)μm，馬特型，兩端鈍，頂胞稍尖，基胞有圓形足跟；小孢子數目較多，0～1隔，大小為(6.1～14.9)μm×(2.2～4.3)μm，卵形或橢圓形或腎形；厚垣孢子單生或串生，壁粗糙(圖3).

A:菌落性狀;B:分生孢子;C:分生孢子梗;D:厚垣孢子.

2.3 病原菌系統發育分析

在基于TEF-1α序列構建的系統發育樹中(圖4)，病原菌68R5b與數據庫中尖孢鐮孢菌(登錄號為DQ837693、AF008481、MT630354、KT239473、FJ985374等)序列相似度達99%以上，聚在同一支；病原菌67R5c與數據庫中茄鐮孢菌(登錄號為MN652888、MN152326、MN652893、MN650108等)序列相似度達99%以上，聚在同一支.結合形態學鑒定和分子鑒定結果，將菌株68R5b鑒定為尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)，菌株67R5c鑒定為茄鐮孢菌(F.solani).

本試驗中供試菌株以粗體字表示，//表示分支進行了縮短，標尺指示10步變化.

2.4 病原菌的生物學特性

2.4.1 培養溫度對病原菌生長和產孢的影響 由表1可知，2種病原菌在40 ℃高溫和5 ℃低溫下幾乎不生長.尖孢鐮孢菌生長適宜溫度范圍為25～30 ℃，最適生長溫度為25 ℃，菌落直徑達49.67 mm.茄鐮孢菌最適生長溫度為30 ℃，菌落直徑為59.00 mm，顯著高于其他溫度處理.在25 ℃時，尖孢鐮孢菌產孢最多，為13.92×106個/mL.在30 ℃時，茄鐮孢菌產孢最多，達到4.23×106個/mL，均顯著高于其他處理.40 ℃高溫條件下2種病原菌均不產孢，且低溫抑制病原菌產孢.

表1 培養溫度對供試病原菌生長和產孢的影響

2.4.2 光照條件對病原菌生長和產孢的影響 由表2可知，不同光照條件對尖孢鐮孢菌的生長無顯著影響，全光照條件下菌落直徑最大，為42.67 mm，且產孢量最大，為4.91×106個/mL，顯著高于全黑暗和光暗交替.全黑暗條件下有利于茄鐮孢菌生長和產孢，菌落直徑為42.67 mm，產孢量為3.73×106個/mL，而全光照和光暗交替則不利于菌絲生長和產孢.

表2 光照條件對供試病原菌生長和產孢的影響

2.4.3 碳源對病原菌生長和產孢量的影響 2種病原菌在供試的6種碳源培養基上均生長良好，而在對照培養基上菌絲非常稀疏或幾乎不生長(表3).尖孢鐮孢菌絲生長和產孢的最適碳源分別是淀粉和蔗糖，菌落直徑為62.50 mm，產孢量為12.7×106個/mL，均顯著高于其他碳源培養基.茄鐮孢菌生長的最適碳源是淀粉，菌落直徑為52.83 mm，其次為乳糖、甘露醇、麥芽糖和葡萄糖；產孢的最適碳源是葡萄糖和蔗糖，產孢量在2.51×106～2.71×106個/mL之間，與其他4種碳源培養基的產孢量差異顯著.

表3 碳源對供試病原菌生長和產孢的影響

2.4.4 氮源對病原菌生長和產孢量的影響 由表4可以看出，與對照相比，2種病原菌在供試的6種氮源培養基上均生長良好.尖孢鐮孢菌生長的最適氮源為蛋白胨，菌落直徑為57.00 mm，硝酸鈉次之，與其他4種氮源培養基差異顯著；氮源為硝酸鉀和蛋白胨時產孢量無顯著差異，平均產孢量為6.31×106～6.43×106個/mL，但顯著高于其他4種氮源培養的病原菌產孢量.茄鐮孢菌生長的最適氮源是蛋白胨，菌落直徑為53.83 mm，顯著高于其他5種氮源；在硝酸銨、硝酸鈉、牛肉膏和蛋白胨為氮源的培養基上，產孢量差異不顯著，硝酸銨為氮源時產孢量最大，為3.65×106個/mL.

表4 氮源對供試病原菌生長和產孢的影響

3 討論

鐮孢菌根腐類病是一類危害嚴重的真菌性病害，可侵染辣椒[20]、黃瓜[21]、番茄[22]和胡蘿卜[23]等蔬菜作物，其病原形態復雜且種類繁多，變異幅度大，僅以形態特征很難鑒定病原種類.因此，在形態學的基礎上結合分子生物學鑒定鐮孢菌的方法已被廣泛應用.胡蘭等[24]研究報道TEF-1α基因序列在鐮孢菌種水平上對親緣關系近的種有高分辨率，可以較好地表現鐮孢菌在種一級的關系；而且TEF-1α基因序列的通用引物易于設計、含有豐富的信息量并且還未發現不存在該基因序列的鐮孢菌類群[25]，本研究采用TEF-1α基因序列結合病原菌形態特征將供試病原菌鑒定為尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)和茄鐮孢菌(F.solani).

本試驗結果表明2種鐮孢菌對辣椒均有致病性，但辣椒致病力存在差異，其中尖孢鐮孢菌致病力強于茄鐮孢菌，是引起辣椒根腐病的主要致病菌.方曉翠等[26]報道了新疆加工辣椒根腐病病原為尖孢鐮孢菌和茄鐮孢菌，尖孢鐮孢菌是優勢菌的試驗結果與本研究一致；張亭亭等[27]發現，尖孢鐮孢菌和串珠鐮孢菌是引起遼寧省辣椒根腐病的主要致病菌，表明地域環境、寄主品種、生態條件和土壤類型的不同，引起辣椒根腐病致病菌菌群和優勢菌存在差異.

生物學特性的研究是病原菌的基礎研究，可為抗病育種和生物防治提供理論依據.本研究結果顯示，引起辣椒根腐病的尖孢鐮孢菌和茄鐮孢菌生長和產孢對溫度、光照、碳源和氮源需求都有一定的差異，表明這2種病原菌雖可同時存在于發病植株內，但在不同的環境條件下，它們侵染寄主以及在寄主體內的擴展能力可能不同，亦或許是優勢病原物種不同所致，對此還需要進一步深入研究.

4 結論

本研究首次報道了發生在甘肅省慶陽市的辣椒根腐病由尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)和茄鐮孢菌(F.solani)引起，致病性測定表明二者均為致病菌.生物學特性研究表明，2種病原菌生長和產孢時對溫度、光照條件、碳源和氮源的需求存在差異.