白肉靈芝水提物對神經元損傷的保護作用及其機制

王昱，秦序，何九軍，王逸璇

(1.隴南師范高等專科學校農林技術學院，甘肅 成縣 742500;2.隴南特色農業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅 成縣 742500；3.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070)

白肉靈芝是我國靈芝屬中一個重要種類，菌肉潔白，多糖和三萜等活性成分含量較高，被視為高品質的靈芝種類[1].現代藥理研究表明白肉靈芝中的生物活性成分穩(wěn)定性高且易通過機體血腦屏障，能促進新生神經元的發(fā)生[2-3]，因此在防治神經退行性疾病中備受關注.本課題組前期研究表明白肉靈芝水提物(Ganodermaleucocontextumaqueous extracts,GLAE)在增加皮膚彈性和減少皮膚皺紋形成方面有重要作用[4].而基于炎癥反應、神經營養(yǎng)因子及相關特異蛋白分子在神經元損傷發(fā)揮保護作用的重要地位，已被學者們認為是診斷神經功能退行性疾病的重要指標與有效治療靶點.研究發(fā)現在炎癥損傷中，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素1(interleukin-1β,IL-1β)是引起神經元炎癥的重要因子，也是反映腦組織損傷的重要指標[5-6].腦源性神經生長因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、β-神經生長因子(β-nerve growth factor,β-NGF) 、原肌球蛋白受體激酶 B(tropomyosin receptor kinase B,TrkB)和原肌球蛋白受體激酶 A(tropomyosin receptor kinase A,TrkA)是重要的神經營養(yǎng)蛋白及受體，對神經元的生長、發(fā)育、分化、維持和損傷修復具有重要作用[7-10].為了進一步探討GLAE的生物學作用，本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導神經細胞炎癥損傷模型，運用ELISA法、免疫組化化學法、Western-blot和PCR等技術對GLAE的抗炎作用機制進行了研究，以期為GLAE的臨床應用提供試驗依據.

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

白肉靈芝水提物為本實驗室培養(yǎng)制備，上海生物工程有限公司測序鑒定為白肉靈芝(Ganodermaleucocontextum).根據文獻[2]，取白肉靈芝子實體干品粉碎機粉碎，60目過篩，96 ℃水浴提取6 h，離心，收集上清，過濾，濾液凍干，得到GLAE.

脂多糖(LPS)來源Escherichia coli 055：B5，Sigma 公司；白細胞介素1(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)放射免疫試劑盒均購自武漢博士德生物工程研究所，批號分別為EK0393、EK0526；ELISA檢測試劑盒(BDNF和β-NGF)，北京百奧萊博科技有限公司，批號分別為ZN2813-TXC、ZN2820-LPN；兔單抗TrkB、TrkA、BDNF、NGF購自Cell signaling 公司，批號為4603、4602、ab222060、ab52918；β-actin，Cell signaling 公司，批號4970L；HRP 標記山羊抗兔IgG購自Servicebio 公司，批號 GB23303；RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑、實時熒光定量PCR試劑購自Taka Ra公司；引物由Invitrogen(上海) 公司設計合成.

主要儀器設備：DYCPZ 型電泳槽、DYY-IB 型電泳儀(北京市六一儀器廠)；DKZ系列恒溫水浴箱(上海一恒科技有限公司)；Image Lab 凝膠分析系統(美國 Bio-Rad 公司)；TGL-16M高速臺式冷凍離心機(美國Beckman-coulter公司)；Nikon FX-35WA顯微鏡(日本Nikon公司)；7900 HT Sequence Detection System定量PCR儀(美國ABI公司).

1.2 試驗動物與給藥

10周齡健康SD大鼠50只，雌雄各半，體質量200～250 g，由蘭州大學實驗動物中心提供，生產許可證：SCXK(甘) 2005-0007.在恒溫(21～23 ℃)、恒濕(45%～65% )、12 h明暗周期的飼養(yǎng)室，全價顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進食和飲水.正常飼養(yǎng)7 d 后用隨機區(qū)組法分為5組，每組10只：對照組、模型組、GLAE低、中、高劑量組[50、100、200 mg/kg)].按照試驗動物福利倫理規(guī)章分別給模型組和GLAE組大鼠連續(xù)2周每日腹腔注射LPS溶液(以體質量計)0.25 mg/kg[11-12]，對照組腹腔注射等體積生理鹽水.同時GLAE組均按10 mL/kg進行灌胃給藥[4]，1 次/d，對照組灌胃等體積的生理鹽水.

1.3 ELISA 法檢測大腦額葉皮層IL-1β、TNF-α、BDNF和 β-NGF含量檢測

末次給藥后，迅速取大腦額葉皮層，洗凈、冰浴勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清液，參考試劑盒說明書測定腦組織L-1β、TNF-α、BDNF和β-NGF含量.

1.4 免疫組織化學法觀察大腦額葉皮層NGF蛋白的表達

采用免疫組化SP法(鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶連結法)：末次給藥后，取大鼠大腦額葉皮層數塊置于4%多聚甲醛固定，經脫水、石蠟包埋后冠狀位切片，厚6 μm，脫蠟、抗 原修復后，用3% H2O2室溫孵育10 min，正常兔血清室溫封閉30 min，然后用NGF抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜；次日取出切片以PBS沖洗后，再依次滴加生物素化羊抗兔IgG 孵育30 min，SABC工作液孵育30 min，最后DAB顯色，蘇木素復染，空白對照以PBS代替一抗.常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照.

用美國Image-pro plus 5.0專業(yè)圖像分析軟件進行圖像分析.從NGF陽性反應的切片中各選3張，檢測活性物質在大腦皮層中表達的強度.測量時保證光源的穩(wěn)定，并且取圖之前預熱20 min以上，采圖時各項設置包括光源、光圈大小、白平衡、曝光強度、敏感度、對比度等均改為手動調節(jié)且固定，以保證每次取圖系統的設置值一樣.取平均光密度和積分光密度2個指標，測量值的平均值為最終灰度值.

1.5 Western blot 各組大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF蛋白的表達

按照常規(guī)方法提取細胞總蛋白，BCA蛋白質試劑盒分別測定各試驗組蛋白量.依次加樣、SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜和室溫封閉.按抗體說明書加入兔抗鼠一抗TrkB、TrkA、BDNF、NGF(均為1∶1 000)，4 ℃冰箱過夜，充分洗滌，加偶聯辣根過氧化物酶(HRP)的二抗IgG(1∶2 000)，ECL顯色，以β-actin(1∶2 000)作為內參照，運用Image Lab 軟件進行曝光成像，采用Quantity one 軟件分析條帶灰度值，試驗重復3次.

1.6 PCR檢測各組大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF mRNA的表達

取大鼠大腦額葉皮層，加入Trizol后在冰浴中勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心 15 min，取上清液通過酚-氯仿抽提RNA，將抽提的RNA 進行逆轉錄反應，實時熒光定量PCR擴增.PCR按照試劑盒說明書進行操作，反應完畢采用 ABI 7500 軟件分析，用公式 2-△△Ct方法進行相對定量.

表1 目的基因引物序列

1.7 數據處理

2 結果與分析

2.1 各試驗組大鼠大腦額葉皮層炎癥細胞因子的變化

由圖1可知，模型組大鼠大腦額葉皮層TNF-α和IL-1β含量均較對照組顯著增高，有極顯著的統計學意義(P<0.01).與模型組比較，GLAE低、中、高劑量組大鼠大腦額葉皮層TNF-α和IL-1β含量均較模型組不同程度降低，有顯著統計學意義(P<0.05，P<0.01).

同列數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P>0.05).

2.2 各試驗組大鼠大腦額葉皮層BDNF和 β-NGF含量的變化

由表2可知，與對照組相比，模型組大鼠大腦額葉皮層BDNF和 β-NGF含量均極顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，GLAE低、中、高劑量組大鼠大腦額葉皮層BDNF和 β-NGF 含量顯著升高(P<0.05，P<0.01).

表2 各試驗組大鼠大腦額葉皮層BDNF和 β-NGF 含量比較

2.3 各試驗組大鼠大腦額葉皮層NGF蛋白的表達

由圖2可知，NGF蛋白陽性表達定位于細胞膜和細胞質內，部分細胞核著色，呈棕黃色，陰性對照組細胞無NGF陽性表達.由表3可知，與對照組相比，模型組大鼠大腦額葉皮層NGF蛋白表達的平均光密度和積分光密度極顯著降低(P<0.01)，表明NGF蛋白的陽性細胞數極顯著減少(P<0.01).與模型組相比，GLAE低、中、高劑量組大鼠大腦額葉皮層NGF蛋白表達的平均光密度和積分光密度顯著增加(P<0.05，P<0.01)，表明NGF蛋白的陽性細胞數顯著增加(P<0.05，P<0.01).

表3 各試驗組大腦額葉皮層NGF蛋白表達的比較

A：對照組；B：模型組；C：GLAE低劑量組；D：GLAE中劑量組；E：GLAE高劑量組；F：陰性對照組； “→”表示陽性細胞.

2.4 各試驗組大鼠大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF蛋白的表達

由圖3可知，與對照組相比，模型組大鼠大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF蛋白表達量極顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，GLAE低、中、高劑量上調了大鼠額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF蛋白的表達水平(P<0.05，P<0.01).

圖3 大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF蛋白印跡分析

2.5 各試驗組大鼠大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF mRNA的表達

由圖4可知，與對照組相比，模型組大鼠大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF mRNA表達顯著下調(P<0.01)；與模型組比較，GLAE低、中、高劑量上調了大鼠大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF mRNA表達水平(P<0.05，P<0.01).

圖4 各試驗組大鼠大腦額葉皮層TrkB、TrkA、BDNF、NGF mRNA表達比較

3 討論

神經炎癥反應與多種疾病的發(fā)生密切相關，減少炎癥因子和相關分子的表達，可降低阿爾茨海默病(AD)、抑郁癥、享廷頓病、帕金森病等疾病的發(fā)生率或延遲發(fā)病、改善癥狀[11-14]，說明神經炎癥參與了AD、抑郁癥等的病理生理學過程.在發(fā)生神經炎癥時，腦組織相關炎癥因子(如TNF-α、IL-1β、COX-2)含量明顯增高，通過激活自身信號轉導，引起炎癥細胞因子產生進一步增加，形成正反饋，導致神經細胞凋亡、與腦組織的損傷程度呈正相關性[7-8].LPS是一種誘導動物模型神經炎癥的常用誘導劑[15].所以，本試驗采用 LPS 誘導大鼠建立神經元炎癥損傷模型，結果顯示模型組大鼠大腦額葉皮層TNF-α和IL-1β含量顯著增加，經GLAE干預后，額葉皮層TNF-α和IL-1β含量顯著降低，這提示GLAE能抑制炎癥因子的釋放，拮抗腦神經炎癥反應，從而發(fā)揮保護腦的作用.

研究表明，神經營養(yǎng)因子是一類由神經所支配的組織產生的且為神經元生長與功能維持所必需的蛋白質分子，但神經營養(yǎng)因子的失常、缺失或不足，往往導致神經系統某些疾病的發(fā)生和神經再生的失敗[16].這提示用這類因子治療神經退行性疾病或促進神經再生具有可能性，也是目前研究或診斷治療神經潰變性疾病的重要靶點.NGF 是最早被發(fā)現的神經營養(yǎng)因子之一，能促進中樞和外周神經元的生長、發(fā)育、分化、成熟，維持神經系統的正常功能，加快神經系統損傷后的修復[7].BDNF是含量最多的神經營養(yǎng)因子，在神經元存活、分化及突觸可塑性調節(jié)中起重要作用[17-18].BDNF和NGF轉錄表達的蛋白分子可促進神經細胞的修復、存活及再生，從而減輕細胞損傷[19-20].在LPS誘導的神經損傷動物模型實驗中發(fā)現，腦組織中BDNF表達減少，神經元凋亡增加，再生能力降低，而將BDNF注入腦組織時可明顯改善損傷癥狀[21-22].TrkB、TrkA 是神經營養(yǎng)因子最主要催化受體，其中mNGF是TrkA的首選配體，mBDNF是TrkB的首選配體.BDNF和NGF蛋白與受體TrkB、TrkA的結合可調節(jié)神經元細胞的生長、存活、分化和可塑性[9-10].本試驗研究顯示，模型組大鼠大腦額葉皮層呈現神經營養(yǎng)因子及其相關因子表達水平顯著下調，經GLAE干預后，大腦額葉皮層的神經營養(yǎng)因子BDNF、NGF 及其受體TrkA、TrkB蛋白和mRNA表達都顯著上調.Keefe 和Ola等[23-24]研究表明BDNF /TrkB、NGF /TrkA 信號通路異常可介導神經元死亡、功能缺失或紊亂繼而導致認知功能的障礙，而激活 BDNF /TrkB、NGF /TrkA 信號通路能明顯改善學習記憶能力和促進神經元的再生.因此推測GLAE可通過BDNF /TrkB、NGF /TrkA 信號通路發(fā)揮對抗炎癥反應而保護神經細胞的作用.

4 結論

綜上所述，GLAE對LPS所致的神經元損傷有一定的保護作用，這種作用可能與GLAE抑制炎癥因子水平，激活BDNF /TrkB、NGF /TrkA信號通路，增加神經營養(yǎng)因子含量，促進大腦皮層神經元生長有關.