何首烏主要成分的肝毒性及其對藥物代謝酶的影響

鄭曉媛　余志杰　王璇　周世文

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）21-2619-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.21.10

摘 要 目的：研究何首烏主要成分的肝毒性，并基于代謝酶探討其毒性機制。方法：采用ADMETlab 2.0平臺預測何首烏的5種主要成分大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、二苯乙烯苷、沒食子酸對肝、皮膚、心臟等的毒性或致癌作用，并評估這些成分對細胞色素P450酶系（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4）的影響;檢測不同濃度（10、20、40、80 μmol/L）的大黃素、大黃酸、二苯乙烯苷、沒食子酸對人正常肝細胞L02存活率的影響;以膽紅素為底物，采用體外反應體系考察何首烏主要成分對葡糖醛酸基轉移酶1家族多肽A1（UGT1A1）活性的影響。結果：何首烏主要成分大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、沒食子酸對肝的毒性作用均較強。大黃素、大黃素甲醚對CYP1A2的抑制作用較強，對CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4的抑制作用為中等;大黃酸對CYP1A2、CYP2C9的抑制作用為中等，二苯乙烯苷和沒食子酸對上述各酶的抑制作用均較弱。大黃素（40、80 μmol/L）和沒食子酸（40、80? ?μmol/L）均可顯著降低L02細胞的存活率（P<0.01）。5、10、20、40、80 μmol/L的大黃素和沒食子酸（5 μmol/L的大黃素除外）對UGT1A1酶的抑制率均顯著升高（P<0.01），大黃素對UGT1A1酶的抑制作用為可逆的競爭性抑制。結論：何首烏主要成分大黃素、大黃酸、大黃素甲醚等具有肝毒性，其作用機制可能與抑制CYP1A2、CYP2C9活性以及競爭性抑制膽紅素代謝限速酶UGT1A1的活性有關。

關鍵詞 何首烏;大黃素;二苯乙烯苷;大黃酸;沒食子酸;細胞色素P450酶;葡糖醛酸酶;肝毒性

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the hepatotoxicity of main components of Polygonum multiflorum， and investigate its toxic mechanism based on metabolic enzymes. METHODS： ADMETlab 2.0 platform was used to forecast the toxic or carcinogenic effects of emodin， physcion， rhein， stilbene glycoside and gallic acid on liver， skin and heart. The effects of those components on cytochrome P450 enzyme system （CYP1A2， CYP2C9， CYP2C19， CYP2D6， CYP3A4） were evaluated. The effects of different concentrations of emodin， rhein， stilbene glycoside and gallic acid （10， 20， 40， 80 μmol/L） on the survival rate of normal hepatocyte L02 were detected. The effects of major components of P. multiflorum on the activity of UGT1A1 enzyme were studied by in vitro reaction system， using bilirubin as substrate. RESULTS： Main components of P. multiflorum， ie. emodin， physcion， rhein and gallic acid， showed strong toxic effects on the liver， while stilbene glycosides possessed weak toxic effects on the liver. Emodin and physcion had strong inhibitory effects on CYP1A2 and medium inhibitory effects on CYP2C9， CYP2D6 and CYP3A4; rhein showed medium inhibitory effects on CYP1A2 and CYP2C9， while stilbene glycoside and gallic acid possessed weak inhibitory effects on the above enzymes. Emodin （40， 80 μmol/L） and gallic acid （40， 80 μmol/L） could significantly reduce the survival rate of L02 cells （P<0.01）. The inhibition rate of 5， 10， 20， 40， 80 μmol/L emodin and gallic acid （except for 5? ? ? μmol/L emodin） on UGT1A1 enzyme increased significantly （P<0.01）， and the inhibition effect of emodin on UGT1A1 enzyme was reversible competitive inhibition. CONCLUSIONS： The main components of P. multiflorum， ie. emodin， rhein and physcion， are hepatotoxic; the mechanism of it may be associated with inhibiting the activity of CYP1A2 and CYP2C9 and competitively blocking rate-limiting enzyme UGT1A1 in the process of bilirubin metabolism.

KEYWORDS? ?Polygonum multiflorum; Emodin; Stilbene glycosides; Rhein; Gallic acid; Cytochrome P450 enzyme; Glucuronidase; Hepatotoxicity

隨著人類生活方式和使用中藥的目的、方式發生改變，中藥的安全性問題日益凸顯，既往認為“補益養身”的何首烏及其制劑引起的肝損傷也屢見報道[1]。何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multliflorum Thunb.的干燥塊根，具有抗衰老、降血脂、抗癌、抗炎、促進免疫調節、保護神經等作用[2];但也有相關研究發現，何首烏提取物可能導致肝毒性、腎毒性和胚胎毒性[3]。

研究發現，何首烏的主要成分有二苯乙烯苷、蒽醌類（包括大黃素、大黃酸、大黃素甲醚等）、鞣質（包括沒食子酸等）和磷脂等，其中大黃素可通過刺激活性氧簇（ROS）的釋放，啟動外源性和內源性細胞凋亡途徑來誘導HepaRG細胞凋亡[4-5];二苯乙烯苷、大黃素甲醚、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、順式二苯乙烯苷、兒茶素等5種成分與何首烏的毒性具有較強的相關性[5]，但具體作用機制尚不明確。

探討藥物對代謝酶的影響是藥物肝毒性研究的重要組成部分。研究發現，藥物在人體內的代謝途徑可分為Ⅰ相代謝途徑和Ⅱ相代謝途徑，其中Ⅰ相代謝途徑主要是氧化和羥基化，Ⅱ相代謝途徑主要是硫酸酯化和葡萄糖醛酸化[6]。細胞色素 P450（CYP450）酶系是Ⅰ相代謝途徑中的主要酶系，可影響多種藥物代謝;葡萄糖醛酸轉移酶（UGTs）是Ⅱ相代謝途徑中的主要酶系，對膽紅素和多種藥物的代謝具有重要作用[6-7]。其中膽紅素經血液循環至肝臟后，可通過UGTs形成膽紅素葡萄糖醛酸化合物，進一步被排泄至膽囊及腸道進行清除;葡萄糖醛酸轉移酶1家族多肽A1（UGT1A1）為該過程的限速酶，當其受到抑制時，可導致膽紅素的清除減慢，從而表現出肝內膽汁淤積，進而損傷肝細胞[7]。

基于此，筆者首先采用ADMETlab 2.0平臺預測何首烏主要成分（大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、二苯乙烯苷、沒食子酸）對肝、皮膚、心臟的毒性或致癌作用，并評估這些成分對細胞色素P450酶系的影響;采用人正常肝細胞L02驗證何首烏主要成分的肝毒性，進而在體外反應體系層面研究何首烏主要成分對UGT1A1酶活性的影響，以期從代謝角度闡明何首烏肝毒性的作用機制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Multiskan SkyHigh型全波長酶標儀、17R型高速低溫離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），AE240 型電子天平（德國Sartorius公司），DK 600型電熱恒溫水槽 （上海精宏實驗設備有限公司），F8型超細勻漿機（德國 Fluko公司） 。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用大黃素（批號E7881）購自美國Sigma公司;大黃酸、二苯乙烯苷、沒食子酸（批號分別為201812、201903、201909）均購自成都曼思特生物科技有限公司;RPMI1640培養基、胎牛血清（批號分別為31800022、10100147）均購自美國Gibco公司; CCK-8試劑盒（批號C0038）購自上海碧云天生物技術有限公司; HLA- UGT1A1酶（批號456411）購自美國Gentest公司;膽紅素測定試劑盒（批號ab235627）購自英國Abcam公司;膽紅素對照品（批號100077-201806，含量99.3%）購自中國食品藥品檢定研究院;其余試劑為實驗室常用規格，水為純化水。

1.3 細胞

人正常肝細胞L02購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

2 方法

2.1 何首烏主要成分的毒性預測

參考文獻[8-9]的方法，采用ADMETlab 2.0平臺（https：//admet.scbdd.com/）進行預測。首先，將何首烏的5種主要成分大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、二苯乙烯苷、沒食子酸的化學結構式輸入該平臺，得出各成分的SMILE表達式;然后預測各成分對肝、皮膚、心臟、呼吸系統、芳烴受體的毒性作用及致癌作用，并評估這些成分對CYP450酶系（包括CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4）的抑制作用。當評估預測值為0～<0.3時，提示成分的毒性/致癌/抑制作用弱;當該預測值為0.3～<0.7時，提示成分的毒性/致癌/抑制作用為中等;當該預測值為0.7～1.0 時，提示成分的毒性/致癌/抑制作用較強。

2.2 何首烏主要成分對L02細胞活性的影響考察

2.2.1 細胞培養 將L02細胞以含10%胎牛血清的DMEM培養基在37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養。待細胞融合度達70%～80%時，以胰酶消化傳代，進行后續實驗。

2.2.2 細胞存活率的檢測及形態學觀察 取對數生長期的L02細胞，按5×103個/孔接種于96孔板中，然后分為大黃素不同濃度組（10、20、40、80 μmol/L，濃度參考文獻[10]進行設置，下同）、大黃酸組不同濃度組（10、20、40、80 μmol/L）、二苯乙烯苷不同濃度組（10、20、40、80? ?μmol/L）、沒食子酸不同濃度組（10、20、40、80 μmol/L），另設不加藥物只加細胞的空白組，每組設5個復孔（大黃素甲醚與大黃素結構類似，故本實驗不設置大黃素甲醚組）。待細胞貼壁后，各組細胞加入相應藥物培養24 h，再加入CCK-8試劑10 μL培養1 h，然后采用酶標儀于450 nm波長下檢測各孔的光密度值（OD），計算細胞存活率[細胞存活率=（OD空白組-OD實驗組）/OD空白組×100%]。細胞存活率檢測結束后，取各組細胞適量分別于顯微鏡下觀察形態，并以大黃素不同濃度組細胞為代表拍照保存（其余組別的細胞顯微圖略）。

2.3 何首烏主要成分對UGT1A1酶活性的影響

2.3.1 UGT1A1酶抑制率的測定 參考文獻[11-12]方法并進行改進，制備尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）-緩沖系統，然后分為大黃素不同濃度組（5、10、20、40、80 μmol/L，濃度根據預實驗結果設置，下同）、大黃酸不同濃度組（5、10、20、40、80 μmol/L）、沒食子酸不同濃度組（5、10、20、40、80 μmol/L）以及空白組（加酶但不加藥物），每組設5個復孔。各組均以膽紅素（0.2 μg/μL）為反應底物，加入UGT1A1酶（0.5 U/L）1 μL以及相應藥物，置于37 ℃恒溫水浴條件下避光反應10 min后，加入冰乙腈-甲醇溶液600 μL終止反應;然后將反應液以15 000 r/min離心 25 min，取上清液175 μL加入96孔板中，并根據膽紅素測定試劑盒說明書方法進行操作，采用酶標儀于550 nm波長處測定各孔OD值，并計算酶抑制率[酶抑制率=（OD空白組-OD實驗組）/OD空白組×100%]。

2.3.2 大黃素對UGT1A1酶動力學的影響考察 以膽紅素系列溶液 （0.125～2 mmol/L）為底物，參考“2.3.1”項下方法，測定不同濃度大黃素[0（作為空白對照）、20、40、80 μmol/L]對UGT1A1酶的抑制率，采用 Lineweave-Burk雙倒數作圖法確定大黃素對UGT1A1酶的反應類型[13]。

2.3.3 大黃素對UGT1A1酶抑制的可逆性考察 參考文獻[14]方法，取UGT1A1酶溶液 （1 U/mL） 0.5 mL與 1 mg大黃素混合，于 37 ℃恒溫水浴條件下預處理1 h，再置于4 ℃的 0. 1 mol /L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.8） 中透析24 h，透析期間每8 h更換1次磷酸鹽緩沖液，作為大黃素透析組;同時，設置只加酶不加大黃素的空白透析組。另取UGT1A1酶溶液（1 U/mL） 0.5 mL與1 mg大黃素混合，不進行透析，直接置于4 ℃條件下保存 24 h 作為大黃素非透析組;同時，設定只加酶不加大黃素的空白非透析組。每組設5個平行。透析（或非透析放置）結束后，將混合溶液分別稀釋10、50、100、500、1 000倍，測定OD值，并計算酶相對活性[酶相對活性=OD實驗組/OD空白組×100%，式中透析或非透析實驗組分別對應相應的透析或非透析空白組]。

2.4 統計學方法

采用SPSS 21.0統計軟件進行分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 何首烏主要成分的毒性預測結果

3.1.1 毒性及致癌作用預測結果 何首烏中的大黃素、大黃素甲醚、大黃酸對肝、芳烴受體的毒性作用較強，二苯乙烯苷對皮膚、芳烴受體的毒性作用較強;沒食子酸對肝、皮膚的毒性作用較強，詳見表1。

3.1.2 酶抑制作用 大黃素、大黃素甲醚對CYP1A2的抑制作用較強，對CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4的抑制作用中等;大黃酸對CYP1A2、CYP2C9的抑制作用中等，對CYP2D6、CYP3A4的抑制作用較弱;二苯乙烯苷和沒食子酸對CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4的抑制作用均較弱;各成分對CYP2C19的抑制作用均較弱，詳見表2。

3.2 何首烏主要成分對L02細胞存活率的影響

與空白組比較，大黃素40、80 μmol/L組和沒食子酸40、80 μmol/L組細胞存活率均顯著降低（P<0.01），且具有一定濃度依賴趨勢;大黃酸不同濃度組和二苯乙烯苷不同濃度組細胞存活率差異無統計學意義，詳見表3。細胞形態觀察結果顯示，空白組細胞形態正常;大黃素不同濃度組細胞隨給藥濃度的增加，表現出明顯的色質凝集、核濃縮、核裂解等，且伴隨發泡、凋亡小體生成，詳見圖1。

3.3 何首烏主要成分對UGT1A1酶活性的影響

3.3.1 UGT1A1酶抑制率 大黃素和沒食子酸不同濃度組（大黃素5 μmol/L組除外）的UGT1A1酶抑制率較空白組均顯著升高（P<0.05或P<0.01），大黃酸不同濃度組的UGT1A1酶抑制率較空白組無統計學意義，詳見表4。

3.3.2 UGT1A1的酶動力學 大黃素對UGT1A1酶的抑制作用與給藥濃度成正比，酶催化反應的最大反應速率（Vmax）以及米氏常數（Km）隨給藥濃度的升高而降低，表明大黃素對UGT1A1酶的抑制作用類型可能為競爭性抑制，詳見圖2。

3.3.3 UGT1A1酶抑制的可逆性 與空白透析組比較，空白非透析組的UGT1A1酶相對活性差異無統計學意義（P>0.05），表明透析對UGT1A1酶的清除無影響;與空白透析組比較，大黃素透析組稀釋10、50倍后的UGT1A1酶相對活性均顯著降低（P<0.01）;與大黃素非透析組比較，大黃素透析組稀釋10、50倍后的UGT1A1酶相對活性均顯著降低（P<0.01），詳見圖3。

4 討論

相關研究發現，患者短期或長期服用何首烏生品及其炮制品可發生肝毒性，嚴重者可發生肝衰竭[15]。英國、澳大利亞和加拿大等國的藥品監督管理部門先后發布了何首烏致肝損傷的警告信息[16]。在我國，國家藥物警戒平臺收到的何首烏及其相關制劑的不良反應報告例次位居中藥類前列，且多數以肝損傷為主;另外，國家藥品監督管理局也屢次發布警示信息，提示何首烏及其相關制劑的肝損傷風險[17-19]。

計算機技術預測藥物肝毒性是美國FDA推薦的常用方法[20]，筆者在本文中采用計算機ADMETlab 2.0平臺對何首烏的5種主要成分大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、二苯乙烯苷、沒食子酸的各器官毒性及致癌作用進行了模擬預測（由于藥物致肝損傷可通過免疫介導途徑損傷全身主要器官，故本文將皮膚、心臟、呼吸系統、芳烴受體均作預測分析[1]）。結果顯示，大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、沒食子酸對肝的毒性作用均較強。進一步通過細胞實驗也發現，大黃素（40、80 μmol/L）和沒食子酸（40、80 μmol/L）均可顯著降低L02細胞的存活率。此外，大黃素、大黃素甲醚對CYP1A2具有較強的抑制作用，對CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4具有中等抑制作用，這與文獻研究結果基本一致[21]。由此推測，大黃素、大黃酸、大黃素甲醚等抑制細胞色素P450酶系的作用可能是何首烏主要成分導致藥物性肝損傷的機制之一。

何首烏引發的肝毒性多伴有膽紅素異常升高的表現，膽紅素的代謝與Ⅱ相代謝途徑中的葡萄糖醛酸結合環節有關，而在葡萄糖醛酸酶的1A1、1A3、1A4、1A5、1A6、1A7、1A8、1A9、1A10等多個異構體中，代謝膽紅素的酶主要是UGT1A1酶[22]。基于此，本研究以膽紅素為底物，從體外反應體系層面研究何首烏主要成分對UGT1A1酶活性的影響。結果顯示，何首烏主要成分大黃素和沒食子酸（5 μmol/L的大黃素除外）對UGT1A1酶的抑制率均顯著升高;進一步通過酶動力學實驗和透析實驗發現，大黃素對UGT1A1酶的抑制作用為可逆的競爭性抑制。由此筆者推測，何首烏主要成分大黃素可通過抑制Ⅱ相代謝途徑中的UGT1A1酶活性，從而增加膽紅素代謝時間;另外，由于該抑制作用是可逆的競爭性抑制，故筆者推測在停止給藥后，UGT1A1酶活性可逐漸恢復。

綜上所述，何首烏主要成分大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、沒食子酸等具有肝毒性，其作用機制可能與抑制CYP1A2、CYP2C9活性以及競爭性抑制膽紅素代謝限速酶UGT1A1的活性有關。

參考文獻

[ 1 ] LIU Y，WANG W P，SUN M Y，et al. Polygonum multiflorum-induced liver injury：clinical characteristics，risk factors，material basis，action mechanism and current challenges[J]. Front Pharmacol，2019，10 （13）：1467.

[ 2 ] 劉芳，李波.藥物引起肝臟損傷的評價與檢測[J].藥物分析雜志，2010，30（10）：1981-1984.

[ 3 ] 任紅微，魏靜，高秀梅，等.何首烏及其主要化學成分藥理作用及機制研究進展[J].藥物評價研究，2018，41（7）：1357-1362.

[ 4 ] ZHENG X Y，YANG S M，ZHANG R，et al. Emodin-induced autophagy against cell apoptosis through the PI3K/AKT/mTOR pathway in human hepatocytes[J]. Drug Des Devel Ther，2019，13（9）：3171-3180.

[ 5 ] DONG X X，FU J，YIN X B，et al. Induction of apoptosis in HepaRG cell line by aloe-emodin through generation of reactive oxygen species and the mitochondrial pathway[J].Cell Physiol Biochem，2017，42（2）：685-696.

[ 6 ] K?HLE C，BOCK K W. Coordinate regulation of phaseⅠandⅡxenobiotic metabolisms by the Ah receptor and Nrf2[J]. Biochem Pharmacol，2007，73（12）：1853-1862.

[ 7 ] VITEK L，OSTROW J. Bilirubin chemistry and metabolism;harmful and protective aspects[J]. Curr Pharm Des，2009，15（25）：2869-2883.

[ 8 ] DONG J，WANG N N，YAO Z J，et al. ADMETlab：a platform for systematic ADMET evaluation based on a comprehensively collected ADMET database[J]. J Cheminform，2018，10（1）：29.

[ 9 ] SHOOMBUATONG W，PRATHIPATI P，PRACHAYASITTIKUL V，et al. Towards predicting the cytochrome P450 modulation：from QSAR to proteochemometric modeling current drug metabolism[J]. Curr Drug Amtab，2017，18（6）：540- 555.

[10] ZHANG H M，WANG F，QIU Y ，et al. Emodin inhibits coxsackievirus B3 replication via multiple signalling cascades leading to suppression of translation[J]. Biochem J，2016，473（4）：473-485.

[11] 汪祺，張玉杰，戴忠，等.微粒體體系中膽紅素及其代謝產物測定方法的建立[J].藥物分析雜志，2015，35（9）：1544-1550.

[12] 汪祺，戴忠，張玉杰，等.基于二相代謝酶介導膽紅素代謝考察不同體系UGT1A1酶動力學參數[J].中國藥學雜志，2015，50（19）：1709-1714.

[13] FUJIMORI Y，WAKUI M，KATAGIRI H，et al. Evaluation of anticoagulant effects of direct thrombin inhibitors，dabigatran and argatroban，based on the lineweaver-burk plot applied to the clauss assay[J]. J Clin Pathol，2016，69（4）：370-372.

[14] CHOWDHURY N R，ARIAS I M，LEDERSTEIN M，et al. Substrates and products of purified rat liver bilirubin UDP glucuronosyltransferase[J]. Hepatology，1986，10（6）：123- 128.

[15] National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases （NIDDK）. Shou wu pian （polygonum multiflorum） in the livertox[EB/OL]. （2019-09-25）[2021-07-12]. https：//www.livertox.nih.gov/ShouWuPian.htm.

[16] 英國藥品與保健品管理局.英國MHRA 警告何首烏的肝損害不良反應[J].中國藥物警戒，2006，3（5）：313.

[17] 國家食品藥品監督管理總局.食品藥品監管總局辦公廳關于修訂養血生發膠囊等6個含何首烏中藥口服制劑說明書的通知[EB/OL].（2013-10-23） [2021-07-12]. http：//samr.cfda.gov.cn/WS01/CL1706/93676.html.

[18] 國家食品藥品監督管理總局.食品藥品監管總局辦公廳關于加強含何首烏保健食品監管有關規定的通知[EB/OL].（2014-07-09）[2021-07-12]. http：//www.sda.gov.cn/WS01/ CL0847/102806.html.

[19] 國家食品藥品監督管理總局. 國家食品藥品監管總局提示關注口服何首烏肝損傷風險[EB/OL]. （2014-07-16）?[2021-07-12]. http：//www.sda.gov.cn/WS01/CL0051/102902.html.

[20] LIU Y，MAPA M S T，SPRANDO R L. Anthraquinones inhibit cytochromes P450 enzyme activity in silico and in vitro[J]. J Appl Toxicol，2021，41（9）：1438-1445.

[21] XIONG G，WU Z，YI J，et al. ADMETlab 2.0：an integra- ted online platform for accurate and comprehensive predictions of ADMET properties[J]. Nucleic Acids Res，2021，49（W1）：W5-W14.

[22] 常乙玲，李娜.何首烏及其制劑致藥物性肝損傷系統性回顧研究[J].中國藥業，2020，29（19）：81-86.

（收稿日期：2021-09-10 修回日期：2021-10-14）

（編輯：唐曉蓮）