PRRSV-VR2332減毒活疫苗不影響豬瘟疫苗和豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生

李 洋，高 勝，焦 點，杜興乾，徐樂樂，鄭紫方，曹鑫宇，肖書奇

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌712100)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)每年給世界范圍內(nèi)的生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，其病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)。PRRSV是動脈炎病毒科的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約15 kb，可分為歐洲型PRRSV(Ⅰ型)和美洲型PRRSV(Ⅱ型)兩種基因型[1]。PRRSV基因組變異速度快，核苷酸取代率高達4.7×10-2～9.8×10-2堿基·年-1，是已知變異速度最快的RNA病毒之一[2-3]。歐洲型PRRSV和美洲型PRRSV間僅共享約60%的核苷酸相似性、50%～80%的氨基酸相似性[4-6]。此外，PRRSV毒株眾多，易于發(fā)生重組而形成新的PRRSV毒株，具備更加復(fù)雜的基因組特性和致病性，這也為PRRS的防控帶來了更大的挑戰(zhàn)[7-11]。雖然PRRS疫苗已退出國家強制免疫，但疫苗接種仍是我國大部分豬場防控PRRS的主要手段。目前我國PRRS疫苗種類較多，大致可分為以高致病性PRRSV毒株(HP-PRRSV)為種毒的HP-PRRS疫苗和以經(jīng)典毒株為種毒的經(jīng)典PRRS疫苗。

由豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)引起的豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circovirus type 2 associated diseases，PCVAD)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬呼吸道綜合征(PRDC)及豬皮炎腎病綜合征(PDNS)等臨床綜合性疾病的統(tǒng)稱[12]。仔豬感染PCV2后易于繼發(fā)其他疾病，特別是PRRS等[13-14]。疫苗接種是防控PCV2的主要手段[15]。

豬瘟(classical swine fever, CSF)，又稱經(jīng)典豬瘟，是由豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的一種熱性、烈性豬傳染病，具有高發(fā)病率和高死亡率[16-17]。豬場常用的豬瘟減毒活疫苗為傳代細胞源豬瘟活疫苗和脾淋源豬瘟活疫苗[18-19]。

PRRSV、PCV2、CSFV往往給豬場帶來巨大的經(jīng)濟損失。更重要的是PRRS作為免疫抑制性疾病，常與PCV2或CSFV感染相伴而發(fā)，甚至發(fā)生PRRSV、PCV2、CSFV的共感染[20-23]。疫苗免疫是豬場防控PRRS等疾病的主要手段。雖然有部分報道分析了HP-PRRSV、PCV2、CSFV疫苗免疫后的效果[24-27]，但考慮到臨床上經(jīng)典PRRSV(VR2332)減毒活疫苗的廣泛使用，探究經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗(VR2332)對PCV2疫苗和CSF疫苗免疫的干擾作用、比較不同免疫方式對仔豬生長性能的影響，可以為經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗(VR2332)與PCV2、CSF疫苗的聯(lián)合免疫提供一定的數(shù)據(jù)支持，為規(guī)?；i場制定科學(xué)合理的免疫程序提供一定的經(jīng)驗參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗主要于2019—2020年在西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院及山東某規(guī)?；i場完成。試驗用豬為該場二元母豬所產(chǎn)的仔豬。在試驗前對仔豬進行了PRRSV、PCV2、CSFV抗體檢測(未進行相關(guān)病原檢測)，挑選PRRSV、PCV2、CSFV抗體為陰性的仔豬進行試驗。

1.2 疫苗及抗體檢測試劑盒

經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗(VR2332)、PCV2滅活疫苗(CP08株)均購自勃林格殷格翰公司、豬瘟減毒活疫苗(傳代細胞源)購自中牧實業(yè)股份有限公司。PRRSV抗體X3檢測試劑盒、CSFV抗體檢測試劑盒均購自愛德士(IDEXX)公司；PCV2抗體檢測試劑盒購自荷蘭百測公司。

1.3 試驗方案

將100頭健康狀況良好的仔豬隨機分為A、B、C、D 4組，每組25頭，用于評估經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗免疫對PCV2疫苗誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的影響。另選100頭健康狀況良好的仔豬隨機分為E、F、G、H四組，每組25頭，用于評估經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗免疫對CSF疫苗誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的影響。各組仔豬具體免疫方案如表1所示。

表1 仔豬免疫方案

A組于21日齡時免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗，7 d后再免疫PCV2疫苗；B組于28日齡時同期分點注射經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗和PCV2疫苗；C組于28日齡時僅免疫PCV2疫苗；D組于28日齡時僅免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗。E組于28日齡時免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗，12 d后再免疫CSF疫苗；F組于28日齡時同期分點注射經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗和CSF疫苗；G組于40日齡時僅免疫CSF疫苗；H組于28日齡時僅免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗。免疫4周后，采集各組仔豬的前腔靜脈血液，分離血清，貯存于-20 ℃?zhèn)溆?。待所有血清收集完畢后，同批次檢測PRRSV、PCV2、CSFV抗體水平，比較不同組的抗體產(chǎn)生水平。

于免疫前、免疫后4周，稱量各組仔豬的體重，計算各組仔豬的平均日增重：平均日增重=(終末體重-初始體重)/間隔時間(d)，以比較不同免疫方案對仔豬生長性能的影響。

1.4 判定標(biāo)準

根據(jù)IDEXX抗體檢測試劑盒說明書的判定標(biāo)準：當(dāng)S/P≥0.4時，PRRSV抗體為陽性；當(dāng)S/P<0.4時，PRRSV抗體為陰性。根據(jù)荷蘭百測公司PCV2抗體檢測試劑盒說明書的判定標(biāo)準：當(dāng)S/P≥0.4時，PCV2抗體為陽性；當(dāng)S/P<0.4時，PCV2抗體為陰性。根據(jù)IDEXX抗體檢測試劑盒說明書的判定標(biāo)準：當(dāng)豬瘟抗體阻斷率>40%時，CSFV抗體為陽性；當(dāng)40%≥豬瘟抗體阻斷率≥30% 時，CSFV抗體為可疑；當(dāng)豬瘟抗體阻斷率<30%時，CSFV抗體為陰性。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

運用GraphPad Prism 5 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用T檢驗法進行不同組數(shù)據(jù)差異顯著性分析。當(dāng)P<0.05時，判定為差異顯著；當(dāng)P<0.01時，判定為差異極顯著；P>0.05時判為差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗免疫對PCV2疫苗誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的影響

如前所述，A組在經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗接種7 d后再注射PCV2疫苗，B組同期分點注射經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗及PCV2疫苗，C組僅接種PCV2疫苗，D組僅接種經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗。結(jié)果顯示A、B、D組均產(chǎn)生了較高水平的PRRSV抗體，且相互間無顯著性差異，共同免疫組A、B組的PRRSV抗體水平甚至略高于D組單獨免疫組(P>0.05, 圖1a)。A、B、C組經(jīng)免疫后均產(chǎn)生了較高水平的PCV2抗體；其中A組PCV2抗體水平最高，顯著高于B組；C組PCV2抗體水平略高于B組，但無顯著性差異(P>0.05, 圖1b)。以上結(jié)果表明經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗免疫并未對PCV2誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生造成明顯干擾。

A.PRRSV免疫7 d后再免疫PCV2；B.同期分點免疫PRRSV和PCV2；C.僅免疫PCV2；D.僅免疫PRRSV；ns.P>0.05；*.P<0.05；***.P<0.01。圖3同

2.2 經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗免疫對CSF疫苗誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的影響

如前所述，E組在經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗接種12 d后再注射CSF疫苗，F(xiàn)組同期分點注射經(jīng)典PRRS減毒活疫苗及CSF疫苗，G組僅接種CSF疫苗，H組僅接種經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗。結(jié)果顯示，共同免疫組E、F及單獨免疫組H組均產(chǎn)生了高水平的PRRSV抗體，其中H組PRRSV抗體水平最高，顯著高于F組(P<0.05)，而略高于E組(P>0.05)，而共同免疫組E、F間并無顯著性差異(圖2a)。共同免疫組E、F和單獨免疫組G組均產(chǎn)生了高水平的CSFV抗體，且相互間無顯著性差異(圖2b)。以上結(jié)果表明，與經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗共同免疫并未干擾CSF疫苗誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生，甚至還略微提高了其抗體水平(P>0.05)。

E.PRRSV免疫12 d后再免疫CSFV；F.同期分點免疫PRRSV和CSFV；G.僅免疫CSFV；H.僅免疫PRRSV；ns.P>0.05；*.P<0.05；***.P<0.01。圖3同

2.3 不同免疫方案對仔豬生長性能的影響

為進一步探究不同免疫方式對仔豬生長性能的影響，分別在免疫前及免疫后28 d時采集A、B、C、D和E、F、G、H各組仔豬的體重數(shù)據(jù)，計算各組仔豬的平均日增重，結(jié)果如圖3所示。

圖3 A、B、C、D和E、F、G、H組仔豬平均日增重

在A～D中，A組的平均日增重最低，顯著低于B、C、D組；D組的平均日增重最高，但相較于B組并無顯著差異。

在E～H中，E組具有最高的平均日增重，顯著高于F、G、H組；F組的平均日增重最低。

3 討 論

豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病、豬瘟是危害生豬產(chǎn)業(yè)的三種重要傳染病，嚴重影響豬場的經(jīng)濟效益，是豬病防控的重點。盡管有多種針對這三種重要病原體的防控方案，但疫苗免疫仍是國內(nèi)使用最多，也是效果最好的方式[28]。PRRS作為免疫抑制性疾病，會對豬體的免疫功能產(chǎn)生特異性或非特異性的抑制作用。有報道稱PRRSV減毒活疫苗免疫可能會對其他疫苗的免疫產(chǎn)生干擾[29-32]?；赑RRSV毒株多樣、經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗的廣泛使用、臨床上PRRSV、PCV2、CSFV常以混合感染的形式出現(xiàn)等原因，探究經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗免疫對PCV2、CSFV疫苗免疫的干擾情況，在有效防控的基礎(chǔ)上篩選對仔豬生長性能更有利的免疫方案是實現(xiàn)生豬綠色健康養(yǎng)殖的重要舉措，對養(yǎng)豬生產(chǎn)具有非常重要的指導(dǎo)意義。

陸佳麗等[25]評價了同時與分別接種HP-PRRSV疫苗和PCV2疫苗誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生水平，發(fā)現(xiàn)無論是同時免疫還是分別免疫，均產(chǎn)生了高水平的PRRSV抗體及PCV2抗體，且無顯著性差異。本研究的結(jié)論與其并不完全一致，免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗7 d后再免疫PCV2疫苗與同期分點免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗和PCV2疫苗均產(chǎn)生了針對兩種病毒的高水平抗體。進一步比較發(fā)現(xiàn)，兩種組合方式免疫產(chǎn)生的PRRSV抗體無顯著性差異，而間隔免疫組的PCV2抗體高于同期分點免疫組。與單獨免疫PCV2疫苗組相比，兩種組合方式免疫均未影響PCV2的抗體水平。意外的是單獨免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗組也檢出了PCV2抗體陽性?；谧胸i在免疫前抗體檢測均為陰性，作者推測該組仔豬可能感染了PCV2野毒。鑒于未在試驗開始前對供試仔豬進行相關(guān)抗原檢測，推測可能是仔豬在試驗開始前處于低水平的帶毒狀態(tài)，但考慮到所有供試仔豬均來自該場本場，且供試仔豬隨機進行分組，試驗均在該場進行，降低了不同組間的誤差，雖然仍對試驗結(jié)果造成了影響，但作者認為其并未對研究結(jié)論造成本質(zhì)上的影響。當(dāng)然，這充分說明了在試驗前對供試仔豬進行相關(guān)抗原的核酸檢測的必要性。

李彩虹等[33]的研究中用HP-PRRSV JXA1-R疫苗與CSF疫苗對種公豬、后備母豬、育肥豬進行了共同免疫，結(jié)果顯示HP-PRRSV JXA1-R疫苗的免疫可能會降低豬群中的CSFV抗體，而提高PRRSV抗體水平。徐孝會等[34]發(fā)現(xiàn)同時免疫兩種疫苗時，CSF疫苗或口蹄疫疫苗會促進HP-PRRSV JXA1-R疫苗誘導(dǎo)的抗體水平。朱華賢等[26]在試驗組仔豬49日齡時接種HP-PRRSV 減毒活疫苗，56日齡時又免疫了CSF疫苗，對照組僅在56日齡時免疫了CSF疫苗。結(jié)果顯示試驗組CSFV抗體水平明顯低于對照組，表明HP-PRRSV JXA1-R疫苗免疫會對CSF疫苗的免疫造成干擾，CSF疫苗免疫應(yīng)在PRRS疫苗免疫后7 d以上進行。本研究中，與單獨免疫CSF疫苗組相比，無論免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗(VR2332)12 d后再免疫CSF疫苗，還是使用經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗與CSF疫苗同期分點免疫，均未影響豬群的CSFV抗體水平，甚至還略微提高了CSFV的抗體水平。作者推測PRRS疫苗對CSF疫苗誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的影響可能與PRRSV疫苗原型毒株的類型有關(guān)，這還需要更進一步的試驗來驗證。但與單獨免疫CSF疫苗組相比，與CSF疫苗同期分點免疫顯著降低了經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗誘導(dǎo)的PRRSV抗體水平，而CSF疫苗的免疫在經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗免疫12 d后再進行時，則可以產(chǎn)生與經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗單獨免疫相似水平的PRRSV抗體，且抗體處于較高水平(S/P值>1.35)。

高杏[15]比較了PCV2疫苗免疫與不免疫對豬生長的影響，發(fā)現(xiàn)免疫PCV2疫苗有助于提升豬的日增重。本研究未與正常組進行平均日增重的比較，但比較了不同免疫方案組仔豬的平均日增重水平。無論與單獨免疫PCV2疫苗組(單獨免疫組)相比，還是與同期分點免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗與PCV2疫苗組(同期分點免疫組)相比，免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗7 d后再免疫PCV2疫苗組(間隔免疫組)顯著均降低了仔豬的平均日增重。而同期分點免疫組仔豬的平均日增重與單獨免疫組相比差異不顯著，但顯著高于間隔時間免疫組。相反，無論與單獨免疫CSF疫苗組相比，還是與同期分點免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗與CSF疫苗組相比，免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗12 d后再免疫CSF疫苗均顯著提高了仔豬的平均日增重。

疫苗接種在誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的同時，往往會不同程度地激活細胞免疫，細胞免疫是機體清除病原微生物的重要手段。本研究僅在體液免疫水平探究了PRRSV減毒活疫苗(VR2332)免疫對PCV2、CSF疫苗免疫誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的影響，并未進行細胞免疫相關(guān)的評估。且目前關(guān)于這3類疫苗免疫，特別是共同免疫下對機體細胞免疫影響的報道較少。Martelli等[35]探究了單獨接種PCV2疫苗或與PRRSV-1疫苗共同接種對豬體液免疫和細胞免疫的影響，發(fā)現(xiàn)共同免疫PRRSV-1和 PCV2疫苗不會干擾特定的體液免疫和細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。孫雪等[36]比較了PRRSV減毒活疫苗(VR2332)與滅活苗同時免疫或單獨免疫的效果，發(fā)現(xiàn)在免疫42 d后，同時免疫組引起豬淋巴細胞增殖速度高于單獨免疫組；而免疫后56 d時, 雖都呈下降趨勢，但單獨免疫減毒活疫苗組具有更高的淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。這些結(jié)果似乎表明共同免疫在產(chǎn)生高水平相關(guān)抗體的同時，對機體細胞免疫的影響可能是一個較為復(fù)雜的情況。鑒于細胞免疫在清除病原體中的關(guān)鍵作用，聯(lián)合免疫對豬細胞免疫的影響值得更多的研究。

綜上，在制定聯(lián)合免疫方案時，除了考慮抗體水平外，還應(yīng)參考免疫方案對仔豬生長性能的影響，綜合選擇科學(xué)、高效、性價比高的聯(lián)合免疫方案。

4 結(jié) 論

1)經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗(VR2332)不影響PCV2滅活苗誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生，且二者同期分點免疫能使仔豬具備更高的平均日增重。2)經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗(VR2332)不影響CSF疫苗誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生，但間隔12 d免疫時效果更好，且能使仔豬具備更高的平均日增重。3)28日齡時同期分點免疫經(jīng)典PRRSV減毒活疫苗(VR2332)和PCV2疫苗，12 d后再免疫CSF疫苗可能是比較理想的聯(lián)合免疫方案，但仍需要進一步驗證。