18β-甘草次酸鈉改善幼鼠變應性鼻炎和鼻黏膜組織病變及對Th1/Th2的平衡機制*

符玉水 符元證 楊輝 鐘麗花 霍開明

(1.海南省婦女兒童醫學中心新生兒科，海南 海口 571924；2.中國醫科大學公共衛生學院衛生毒理學教研室，遼寧 沈陽 110013；3.海南醫學院第二附屬醫院兒科，海南 海口 570311)

變應性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)是一種常見的變態反應介導的炎癥性疾病，其特征是鼻塞、鼻充血、打噴嚏和鼻癢等[1]。據統計，AR在全球的發病率約為25%～35%，在我國AR的發病率不斷上升，它與其他炎癥性疾病如哮喘、鼻竇炎、過敏性結膜炎、滲出性中耳炎和腺樣體肥大等密切相關[2-3]，其發病與多種因素有關，主要包括Th1/Th2細胞分化失衡、炎癥介質釋放及免疫球蛋白E升高[4]。甘草次酸(Glycyrrhetinic acid，GA)為甘草主要活性成分之一的五環三萜烯衍生物，具有與甘草酸相同的藥理作用，可發揮抗腫瘤、抗潰瘍、抗炎以及延緩自身免疫性疾病發展的作用[5-7]。18β-甘草次酸鈉(18β-SGA)是甘草次酸的鈉鹽制劑，已有研究證明18β-SGA在抑制AR方面具有一定的可行性[8]，但其治療AR的具體機制尚未明確，本研究擬通過構建AR 大鼠模型，進一步觀察18β-SGA對AR大鼠鼻黏膜的作用并探究相關分子機制，為闡明AR發病機制和探索新的AR治療途徑提供了依據，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級Sprague-Dawley大鼠，7 日齡，體質量(18.4±2.2)g，購自中國醫科大學實驗動物中心。將新生SD幼鼠與母鼠同籠適應性喂養，飼養箱環境設置為溫度25℃～28℃、濕度 60%～80%，給予光照與黑暗各12 h交替。本研究符合實驗動物3R原則，并經海南省婦女兒童醫學中心倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和氫氧化鋁[Al(OH)3]干粉購自美國Sigma公司；伊紅染色液、蘇木素染色液、RIPA裂解液和BCA 蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；IL-2、IFN-γ、IgE、IL-4、IL-5大鼠特異性ELISA試劑盒購自購自上海西唐生物有限公司；免疫組織化學染色，抗體p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt購自北京博奧森生物技術有限公司；抗體histone H2、NF-κB p65、ICAM-1、TGF-β1、β-actin購自美國 Abcam 公司；HRP標記的山羊抗兔二抗購自上海碧云天生物技術公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制作 參考文獻方法[9]建立大鼠變應性鼻炎(AR)模型，首先進行基礎致敏：在0.3 mg卵清蛋白(OVA)和30 mg 氫氧化鋁[Al(OH)3]中加入生理鹽水1 mL混勻，制成混懸液，腹腔內注射，隔日注射1次，共7次，對照組大鼠以等量生理鹽水進行腹腔注射；接著進行鼻腔激發：以50 μL 的2% OVA滴鼻，采用微量進樣器從雙側鼻腔滴入，每天1次，共7次，對照組以等量生理鹽水滴入鼻腔。

1.3.2 分組與給藥 將50只新生SD幼鼠按照隨機數字表法分為五組，包括：對照組、模型組、18β-SGA 低劑量組、18β-SGA高劑量組和地塞米松組，每組10只。模型組、18β-SGA低劑量組、18β-SGA高劑量組和地塞米松組建立AR模型。造模完成后開始給藥治療，18β-SGA 低劑量組、18β-SGA高劑量組分別按照20 mg·kg-1、40 mg·kg-1進行腹腔注射，地塞米松組大鼠以1.5mg·kg-1進行腹腔注射，對照組和模型組同時注射生理鹽水。每日注射一次，共持續4 周。

1.3.3 變應性鼻炎癥狀評分 在處死大鼠前，采用5% OVA滴鼻，觀察30 min內大鼠噴嚏、鼻溢和搔鼻動作的行為，并采用疊加量化計分。①噴嚏：1～4個為1分，5～10個為2分，10個以上為3分。②流鼻涕：流至鼻孔前為1分，流出鼻孔為2分，流至面部計為3分。③撓癢：單前肢偶有撓鼻為1分，雙前肢撓鼻為2分，雙前肢不停撓鼻為3分。

1.3.4 ELISA 斷頸法處死各組大鼠，腹主動脈采血，室溫靜置2h，4℃低溫離心機以離心半徑為10cm、4000r/min離心15 min，獲取上清，使用大鼠特異性ELISA試劑盒檢測血清中IL-2、IFN-γ、IgE、IL-4及IL-5水平，步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.5 HE染色 處死大鼠后分離鼻骨前皮膚，咬除鼻骨，迅速取出雙側鼻腔黏膜組織，置于4%多聚甲醛中固定。將組織進行石蠟包埋，切成5 μm石蠟切片后，進行蘇木精-伊紅染色觀察組織學改變。切片采用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，使用蘇木精染色5 min，流水沖洗后，伊紅染色3 min，流水再次沖洗，梯度乙醇脫水后，二甲苯透明10 min，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察鼻腔黏膜組織形態變化并拍照。

1.3.6 免疫組織化學染色 將鼻腔黏膜組織石蠟切片二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，在0.3% 過氧化氫中處理 30 min，高溫(98℃)下加熱5 min，加入山羊血清室溫孵育1 h，加入兔抗ICAM-1(1∶100)、TGF-β1(1∶100)與NF-κB(1∶50)，4℃孵育過夜。PBS 液洗后，加二抗室溫孵育1h。滴加 DAB 顯色，自來水洗滌，加蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察圖像并拍照。

1.3.7 Western blot 將鼻黏膜組織充分剪碎，用 PBS清洗，加入RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，通過BCA法測定蛋白質含量。以30μg蛋白的量加樣并通過10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白質，然后轉移至聚偏氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜后，加入稀釋后的一抗p-PI3K(1∶1000)、PI3K(1∶1000)、p-Akt(1∶1000)、Akt(1∶1000)、NF-κB p65(1∶1000)以及histone H2(1∶1000)、β-actin(1∶1000)，4℃下孵育過夜。次日，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5000)，室溫下孵育1 h，TBST洗膜后，滴加ECL化學發光液顯色曝光，凝膠成像系統拍照，使用Image Pro-Plus分析系統對蛋白條帶進行分析。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學評分結果 通過對各組大鼠觀察發現，正常組大鼠未見明顯噴嚏、流涕表現，偶有抓鼻；與正常組比較，AR組大鼠均出現明顯的煩躁不安、打噴嚏、流涕、頻繁抓鼻等現象，AR行為學評分顯著增加(P<0.01)，且高于 5 分；與模型組比較，18β-SGA 低劑量組、18β-SGA高劑量組和地塞米松組大鼠打噴嚏、流涕、抓鼻等現象有所減輕，AR行為學評分均顯著下降(P<0.01)，見表 1。

表1 各組大鼠行為學評分比較

2.2 各組大鼠鼻粘膜組織病理學觀察 HE染色結果顯示，在對照組大鼠的鼻粘膜組織中未見明顯的損傷，鼻黏膜組織結構整齊、有序排列；模型組大鼠鼻粘膜組織可見明顯的血管擴張、水腫和嚴重炎性細胞浸潤；18β-甘草次酸鈉低劑量組鼻黏膜組織仍有水腫，伴有輕度的炎癥細胞浸潤，但較模型組鼻粘膜組織病理變化得以改善，18β-甘草次酸鈉高劑量組鼻黏膜組織水腫、炎癥細胞浸潤的現象較18β-甘草次酸鈉低劑量組明顯減輕。地塞米松組鼻黏膜組織病理變化改善效果較18β-甘草次酸鈉低、高劑量組更好，見圖1。

圖1 各組大鼠鼻黏膜組織病理圖片(HE，200×)

2.3 各組大鼠血清Th1/Th2 細胞因子表達比較 ELISA 檢測結果顯示，模型組 IL-2、IFN-γ 含量顯著低于對照組，IgE、IL-4及IL-5 顯著高于對照組(P<0.01)；與模型組比較，18β-甘草次酸鈉低、高劑量組與地塞米松組IL-2、IFN-γ 含量顯著升高，而IgE、IL-4及IL-5水平顯著低于模型組(P<0.01)，見圖2。

圖2 各組大鼠血清IL-2、IFN-γ、IgE、IL-4與IL-5水平檢測

2.4 各組鼻黏膜組織中 ICAM-1、AQP5和 NF-κB測定結果 免疫組織化學染色結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織中ICAM-1、AQP5著色較深，NF-κB在細胞質和細胞核中均有著色，三種蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，18β-SGA 低劑量組、18β-SGA高劑量組和地塞米松組中，ICAM-1、AQP5著色較淺，NF-κB主要在細胞質中著色，這三種蛋白表達均顯著下降(P<0.05)，見圖3、表2。

圖3 各組大鼠鼻黏膜組織中 ICAM-1、AQP5和 NF-κB(免疫組化染色，200×)

表2 大鼠鼻粘膜組織 ICAM-1、AQP5和 NF-κB平均光密度比較

2.5 各組大鼠鼻粘膜組織NF-κB 與PI3K-Akt信號通路相關蛋白表達 Western blot檢測結果顯示，模型組鼻粘膜組織中p-PI3K、p-AKT及NF-κB p65蛋白表達量顯著上升(P<0.05)；而18β-甘草次酸鈉低、高劑量組與地塞米松組中p-PI3K、NF-κB p65蛋白表達受到抑制，較模型組均顯著下降(P<0.05)，18β-甘草次酸鈉高劑量組與地塞米松組中p-AKT蛋白表達量較模型組也顯著下降(P<0.05)；而各組間PI3K、AKT蛋白表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4、表3。

圖4 Western blot檢測各組大鼠鼻黏膜組織NF-κB 與PI3K-Akt信號通路相關蛋白表達

表3 各組大鼠粘膜組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、NF-κB p65蛋白表達量比較

3 討論

變應性鼻炎(AR)是成人和兒童哮喘發生的危險因素之一，AR患者表現出由IgE介導的炎癥反應，其特征在于Th2免疫學模式與肥大細胞、嗜酸性粒細胞的活化以及對暴露于過敏原的炎癥介質的釋放[4]。AR反應中當過敏原與鼻粘膜接觸后，肥大細胞立即分泌并釋放炎性介質如組胺、白介素等，從而誘導包括打噴嚏、瘙癢和流鼻涕等急性過敏反應，當在過敏原中繼續暴露6～10 h后，在鼻腔中發生炎性細胞如嗜酸性粒細胞浸潤，嗜酸性粒細胞來源的介質誘導上皮損傷并導致鼻粘膜腫脹[10]。

本研究通過使用OVA誘導AR大鼠模型觀察18β-甘草次酸鈉的抗過敏作用。OVA 致敏后的大鼠出現煩躁不安、打噴嚏、流涕、頻繁抓鼻等現象，鼻黏膜組織可見明顯的結構破壞、血管擴張、水腫和炎性細胞浸潤等病理改變，說明AR大鼠模型構建成功。經過18β-甘草次酸鈉治療后，大鼠打噴嚏、流涕、抓鼻等現象較模型組有所減輕，顯著改善了鼻黏膜組織鼻黏膜水腫、血管擴張和炎性細胞浸潤。與先前研究結果一致，本研究也顯示出18β-甘草次酸鈉對于AR大鼠具有一定的治療功效。

輔助性T細胞是機體內具有特異性和非特異性免疫調節功能的細胞，根據分泌細胞因子種類的不同可分為Th1細胞和Th2細胞，Th1/Th2失衡與過敏性疾病的發病機理密切相關[11]。研究表明，AR后Th1細胞因子表達受抑制和Th2 細胞因子表達增加導致了Th1/Th2 失衡[12]。由于過敏原以肥大細胞的Th2免疫模式和由嗜酸性粒細胞產生的炎性浸潤物的相互作用為特征，因此AR是一種IgE介導的鼻粘膜炎性疾病，Th2細胞可能在AR的發展中起重要作用，而抑制Th2細胞過度分泌以調節Th1/Th2免疫平衡成為治療AR的新靶點[13]。由Th1 細胞分泌的細胞因子，如IL-2 具有促進 T 細胞活化與增殖的作用，IFN-γ能夠抑制 B 細胞合成IgE，同時抑制 Th0 細胞向 Th2 型細胞分化；Th2 細胞主要分泌IL-4、IL-5等細胞因子，研究顯示IL-4能夠拮抗 IFN-γ，可促進B細胞合成IgE與Th0細胞分化為 Th2 細胞[14-15]。本研究結果顯示，18β-甘草次酸鈉可抑制IL-2、IFN-γ下降與IgE、IL-4及IL-5水平的升高，調節 Th1/Th2 細胞因子平衡，從而對變應性鼻炎大鼠起到保護作用。

細胞間黏附分子-1(ICAM-1)是黏附分子中免疫球蛋白超基因家族成員，ICAM-1在各種細胞類型，如成纖維細胞、白細胞、角質形成細胞、腫瘤細胞的表面上表達，增強與內皮細胞間的黏附作用[16]。研究表明，ICAM-1在變應性炎癥組織中表達急劇增加，沉默ICAM-1可下調炎性細胞因子的水平，并抑制嗜酸性粒細胞和肥大細胞的浸潤[17]。水通道蛋白 5(AQP5)是一種水特異性通道蛋白，是變態反應性炎癥期間的分泌限速屏障，在AR鼻黏膜組織中AQP5表達升高，并致使腺體過度分泌[18]。本研究顯示，經過18β-甘草次酸鈉治療的大鼠，鼻黏膜組織中ICAM-1和AQP5蛋白表達水平均下降。有研究表明，NF-κB 通路參與了AQP5 的表達調控[19]。NF-κB作為與炎癥密切相關的轉錄因子，活化后能誘導炎癥細胞因子的表達以加重變應性炎癥的病理反應，在AR中NF-κB途徑可被上皮細胞中的組胺所激活，NF-κB p65是一類典型的NF-κB亞基，存在于轉錄激活區域，當AR發生后，NF-κB釋放，游離的NF-κB以異源二聚體形式NF-κB p65和NF-κB p50轉移至細胞核，通過激活相關轉錄途徑而加重炎癥反應[20]。本研究中，18β-甘草次酸鈉可抑制鼻黏膜組織中NF-κB p65蛋白表達，抑制了NF-κB通路激活，以減輕AR后的炎癥反應。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路參與多種細胞活動和多種病理機制，與細胞增殖、分化、凋亡及代謝等密切相關。PI3K家族由磷酸肌醇催化的激酶組成，AKT是PI3K的關鍵下游靶蛋白，是細胞中重要的信號傳導途徑，能夠響應各種外源刺激而磷酸化至其功能性狀態，從而調控細胞生物學行為。此外，PI3K/AKT通路參與調節免疫細胞功能來影響AR的發生發展。Ceng等[21]研究發現在肥胖過敏性鼻炎中，瘦素介導的骨橋蛋白表達上調促進了Th 細胞向Th2細胞分化，進而增加了炎癥反應，且該過程是通過調控PI3K/AKT信號通路途徑實現的。本研究結果顯示，18β-甘草次酸鈉作用于AR幼鼠后，鼻粘膜組織中p-PI3K、p-AKT水平均明顯下調，說明18β-甘草次酸鈉阻礙了PI3K-Akt信號通路激活，從而發揮對AR的改善作用。

4 結論

18β-甘草次酸鈉改善AR幼鼠鼻黏膜組織病變，調節Th1/Th2 細胞因子平衡，下調鼻黏膜組織中 ICAM-1、AQP5蛋白表達，抑制NF-κB 與PI3K-Akt信號通路的激活，對AR幼鼠具有一定保護作用。然而AR病理機制較為復雜，18β-甘草次酸鈉是否通過其它通路對AR產生作用和影響仍需進一步進行探索。