乳腺癌組織中Bmi-1和CARD9表達及其與淋巴結轉移和預后的關聯*

張瑞瑞 趙桓玉 周武碧 孫艷蘭 劉海燕

(南京醫科大學附屬淮安第一醫院病理科，江蘇 南京 223300)

乳腺癌是發生于乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，其發病率居女性惡性腫瘤之首，已嚴重影響了患者的生命健康[1-2]。目前，分子靶向技術已成為各類惡性腫瘤治療的熱點，但乳腺癌的靶向藥物治療效率低下且價格較為昂貴，故研究乳腺癌發生、發展的分析機制，并探索新的靶標是提高該疾病的治療效率的重點[3-4]。Bmi-1基因屬于轉錄抑制因子基因家族成員，調控細胞周期，并可通過結合INK4a位點，抑制pRb和p53蛋白介導的細胞凋亡，導致細胞生化、惡變甚至腫瘤化[5]。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containingprotein 9，CARD9)是一個重要的銜接蛋白，可調節核轉錄因子等信號通路，與胃癌、腎癌等多種惡性腫瘤存在者密切聯系[6]，但目前其與乳腺癌發生、發展過程的聯系至今尚無定論。故本研究通過分析乳腺癌患者癌組織及癌旁組織的Bmi-1、CARD9表情情況，旨在探究癌組織中Bmi-1、CARD9表達與淋巴結轉移、預后的關聯性，為乳腺癌的治療及病情預測提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經我院倫理委員會審核通過，以2017年1月～2018年11月96例乳腺癌患者為研究對象。納入標準：①符合《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范(2015版)》[7]中關于乳腺癌的診斷標準，并經病理學檢查確診為乳腺癌患者。②患者知曉本研究的研究內容，且已簽署同意書。③均行手術治療。④臨床資料完整者。排除標準：①嚴重肝腎功能異常者。②乳腺良性腫瘤患者。③其他原發性惡性腫瘤疾病患者。④入組前1個月內有激素替代治療史患者。⑤入組前已接受手術或放化療治療者。⑥妊娠或哺乳期婦女。

1.2 方法 標本采集：取距病灶邊緣>3 cm處的癌旁非腫瘤組織(經快速病理學檢查證實為正常組織)0.1 g及腫瘤組織0.2g。Bmi-1表達檢測:采用免疫組化法乳腺癌組織及癌旁組織中Bmi-1表達情況，應用北京中衫公司的免疫組化試劑盒，石蠟標本連續4um切片，將切片放置于二甲苯中脫蠟，10 min/次，共2次，然后行乙醇梯度水化處理，蒸餾水沖洗15 min，應用EDTA修復液進行常規修復，在微波爐中高火3 min預熱至沸騰，然后中低火加熱20 min以暴露抗原位點，待其自然冷卻后，應用1‰的PBS溶液沖洗3次，緊接著用3%H2O2去離子水孵育10 min；在溶液中滴加美國upatate公司的鼠抗人Bmi-1單克隆抗體(稀釋度為1∶200)，在4℃下孵育過夜，然后用PBS溶液漂洗3次，5 min/次，滴加北京中衫公司SPKIT A液后在室溫下孵育15 min，用PBS溶液漂洗后滴加B液，在室溫下孵育10～15 min后再次應用PBS溶液漂洗3次，DBA顯色10 min，終止顯色，用PBS液代替一抗做陰性對照，Bmi-1陽性表達判斷標準：光學顯微鏡下可觀察到陽性表達的細胞核內呈棕黃色或棕褐色顆粒。CARD9表達檢測：用二甲苯進行脫蠟處理，并用醇梯度洗脫，應用0.3#過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性，然后將組織切片與CARD9兔抗人單克隆抗體(美國Abcam公司)在4℃下孵育過夜，隨后與辣根過氧化物酶在室溫下溫育30 min，用SP法顯示免疫反應性，用PBS液代替一抗做陰性對照。CARD9表達判斷標準：陰性為未見陽性染色細胞，陽性為可見深棕黃色或淡黃色細胞著色，每個切片至少觀察5個視野。

1.3 觀察指標 ①比較乳腺癌組織及癌旁組織中Bmi-1、CARD9表達情況。②統計患者臨床病理資料，包括年齡、TNM分期、病理類型、組織學分級、淋巴結轉移等，比較乳腺組織中Bmi-1、CARD9陽性表達及陰性表達患者病理資料的差異性，并分析影響乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達的危險因素。③預后：所有患者均術后術后隨訪1年，采用電話隨訪的方式對患者生存情況進行隨訪，比較乳腺組織中Bmi-1、CARD9陽性表達及陰性表達患者的1年生存率及死亡率，并分析乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況對術后1年生存情況的預測價值。

1.4 統計學分析 采用SPSS 23軟件行統計學分析，計數資料以百分比表示，采用2檢驗比較組間差異；計量資料經正態檢驗后以均數±標準差表示，用t檢驗比較組間差異；采用多元logistics回歸分析影響乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達的危險因素；采用Log-rank檢驗對生存曲線進行比較；采用ROC曲線分析乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況對術后1年生存情況的預測價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者病理類型 患者年齡39～72歲，平均(52.31±7.18)歲；TNM分期：Ⅰ期19例、Ⅱ期23例、Ⅲ期29例、Ⅳ期25例；病理類型：浸潤性癌36例、髓樣癌29例、黏液腺癌31例；組織學分級：Ⅰ級43例、Ⅱ級30例、Ⅲ級23例；腫瘤長徑：≥2 cm 38例、<2 cm 58例；存在淋巴結轉移者34例。

2.2 乳腺癌組織及癌旁組織中Bmi-1、CARD9表達情況分析 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9陽性表達率均高于癌旁組織(P<0.05)，見表1。

表1 乳腺癌組織及癌旁組織中Bmi-1、CARD9表達情況分析[n，n(×10-2)]

2.3 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況與臨床病理關系 Bmi-1陽性表達組在TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期、組織學分級為Ⅲ級、腫瘤長徑≥2 cm、存在淋巴結轉移、ER+方面的人數比例高于Bmi-1陰性表達組，CARD9陽性表達組在TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期、腫瘤長徑≥2 cm、存在淋巴結轉移方面的人數比例高于CARD9陰性表達(P<0.05)，見表2。

表2 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況與臨床病理關系

2.4 影響乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達的多因素分析 TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期、腫瘤長徑≥2cm、存在淋巴結轉移是影響Bmi-1表達的危險因素，TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期、存在淋巴結轉移是影響CARD9表達的危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達的多因素分析

2.5 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況與預后關系 Bmi-1、CARD9不同表達情況的1年生存率對比無明顯差異(P>0.05)，見表4、圖1。

圖1 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達與預后的生存曲線分析

表4 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況與預后關系[n，n(×10-2)]

2.6 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況對預后的預測價值 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況預測患者術后1年生存情況的AUC分別為0.561、0.628，見表5、圖2。

表5 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況對預后的預測價值

圖2 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況預測術后1年生存情況的ROC曲線分析

3 討論

Bmi-1基因PcG家族中的核心成員之一，對胚胎期哺乳動物骨骼、造血及神經的發育發揮重要作用，其具有阻抑子功能，可阻斷細胞周期中兩種關鍵抑制蛋白，并可與c-myc協同作用引起細胞轉化和腫瘤形成[8-9]。CARD9是CARD蛋白家族中的一員，定位于細胞質中，并存在于人體多種組織中，同時在多種癌細胞系中有大量表達，提示其或與腫瘤的生長增殖有關[10-13]。本研究對乳腺癌組織及癌旁組織中Bmi-1、CARD9表達情況進行分析，結果發現乳腺癌組織Bmi-1、CARD9陽性表達率均高于癌旁組織，表明乳腺癌細胞中存在Bmi-1、CARD9高表達的現象。

相關報道指出，多種腫瘤細胞中Bmi-1呈現為高表達狀態，使腫瘤細胞不斷更新成為癌癥干細胞，其表達水平與腫瘤的發生、發展、侵襲、預后等病理指標相關[14-16]。但目前尚不知其與乳腺癌的病理特征的關系，為此本研究進行了相關研究，結果發現TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期、腫瘤長徑≥2cm、存在淋巴結轉移是影響Bmi-1表達的危險因素，說明Bmi-1表達與TNM分期、腫瘤大小、淋巴結轉移有關，這可能是與Bmi-1基因可激活端粒酶逆轉錄酶的轉錄，誘導端粒酶活性，而促進腫瘤增殖有關[17-19]。CARD9為銜接蛋白，可通過蛋白間的相互作用調節NF-kB等信號通路，調控腫瘤壞死因子、白介素等免疫因子的表達，并能調節機體固有免疫反應，對于維持機體微環境的穩態發揮著重要作用[20-22]。局部微環境的炎癥反應是誘導癌癥發生、發展的重要因素，慢性炎癥可促進癌癥的發生，并參與了腫瘤發生、轉移等的病理過程[23]。有研究指出，CARD9表達情況與腫瘤的惡性程度有關[24-25]。本研究結果顯示，TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期、存在淋巴結轉移是影響CARD9表達的危險因素，表明，這主要是因為CARD9異常表達可促進病理炎癥反應的發生，而炎癥參與了腫瘤的發生，引起未惡化的癌細胞擴增，促進血管生成，有利于腫瘤細胞的生長、擴增，也促進惡性腫瘤細胞擴散，進而導致腫瘤出現淋巴結轉移現象[26-27]。

經上述研究可知，Bmi-1、CARD9表達與乳腺癌的發生發展過程的存在一定的聯系，提示其表達情況或與預后相關。但本研究發現，Bmi-1、CARD9不同表達情況的1年生存率對比無明顯差異，乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況預測患者術后1年生存情況的AUC均小于0.7，表明Bmi-1、CARD9表達情況與預后無較大關聯，且對預后的預測價值較低，與既往研究結果存在差異[28-39]，這可能與本研究樣本量少、且研究時間尚短有關，故后期需延長預后觀察時間，以進一步分析Bmi-1、CARD9表達與預后的關系。本研究不足之處在于，納入病例的TNM分期及病理類型的人數比例并不均勻，可能對研究結果造成誤差，并且本研究在進行預后分析時，觀察時間較短，未分析術后3年、5年生存率，無法準確得到Bmi-1、CARD9表達與預后的關系，故后續需延長研究時間以分析其與預后的關聯。

4 結論

本研究結果顯示，乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9陽性表達率較高，且其陽性表達與淋巴結轉移、TNM分期相關，但Bmi-1、CARD9表達情況與術后1年生存情況無明顯關聯。