PINK1通過磷酸化HDAC3對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤CD20表達(dá)的影響*

宋晶晶 常韜 李穎 張詩彤

(承德醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，河北 承德 067000)

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)屬于非霍奇金淋巴瘤病理類型之一，若未進(jìn)行及時有效地干預(yù)，患者病情進(jìn)展迅速，其中位生存時間不超過12個月[1]。目前臨床通常采用CHOP化療手段對DLBCL患者進(jìn)行干預(yù)，然而不同類型的患者5年生存率亦具有顯著差異[2]。故深入探究DLBCL分型、分子機(jī)制及病因?qū)ρ邪l(fā)新型靶向藥物及改善患者預(yù)后具有重要意義。PTEN誘導(dǎo)激酶(PTEN-induced putative kinase 1，PINK1)在癌癥及帕金森病中經(jīng)常出現(xiàn)突變，其廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、骨骼肌等器官組織，除此之外，亦可表達(dá)于細(xì)胞核[3-4]。既往研究顯示，PINK1具有提高細(xì)胞生存率、抗凋亡及保護(hù)作用，這些生物學(xué)活性主要是通過線粒體及細(xì)胞質(zhì)中的PINK1發(fā)揮作用[5]。組蛋白去乙酰化酶3(Histone deacetylase 3，HDAC3)主要表達(dá)于細(xì)胞核，其可在細(xì)胞核中發(fā)揮乙酰化功能并阻斷DNA轉(zhuǎn)錄[6-7]。CD20可在大部分B細(xì)胞惡性腫瘤患者體內(nèi)檢測到，然而在不同類型患者體內(nèi)差異明顯[8]，臨床報道表明，CD20陰性DLBCL患者臨床預(yù)后不良[9]。關(guān)于PINK1、HDAC3、CD20在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中的研究報道較少，因此本次研究旨在探究PINK1通過磷酸化HDAC3對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤CD20表達(dá)的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 DLBCL細(xì)胞系OCI-Ly7購于武漢維克賽思科技有限公司，將細(xì)胞系置于IMDM培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%請鏈霉素)中孵育然后放入恒溫培養(yǎng)箱中，待其生長至一定密度，將其轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基進(jìn)行傳代。

1.2 試劑與儀器 試劑：IMDM培養(yǎng)基購于武漢益普生物科技有限公司；胎牛血清購于蘭州榮曄生物科技有限責(zé)任公司；細(xì)胞裂解液購于北京伊塔生物科技有限公司；PVDF膜購于北京百奧萊博科技有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光購于沈陽萬類生物科技有限公司；抗PINK1、HDAC3、CD20抗體購于北京義翹神州科技股份有限公司。儀器：超凈工作臺購于上海輔澤商貿(mào)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購于上海信裕生物科技有限公司；熒光顯微鏡購于廣州科適特科學(xué)儀器有限公司；-80℃冰箱購于南京貝登醫(yī)療股份有限公司；酶標(biāo)儀購于北京安麥格貿(mào)易有限公司；離心機(jī)購于德祥科技有限公司；制冰機(jī)購于上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 方法 ①取部分OCI-Ly7細(xì)胞系隨機(jī)分為對照組，sh-PINK1組、sh-Con組，對照組細(xì)胞不作任何處理，sh-PINK1組細(xì)胞予以PINK1敲低處理，sh-Con組作抑制對照。②提取細(xì)胞RNA及總蛋白，采用實時熒光定量PCR法檢測各組細(xì)胞PINK1、CD20 mRNA蛋白表達(dá)水平。將RNA放入試劑盒內(nèi)并置于冰上，取提前準(zhǔn)備好的新EP管，做好標(biāo)記后注入0.9mL Trizol，輕輕晃動使其混勻，然后放入離心機(jī)中以1500r/min速度離心20分鐘，并轉(zhuǎn)移至新EPP管中；將異丙醇注入EP管病震蕩15秒，靜置10分鐘后再次轉(zhuǎn)移至離心機(jī)中以1500r/min速度離心20分鐘，棄上清液，然后將EPP管放于超凈工作臺，靜置20分鐘后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳或置于超低溫冰箱中保存。③采用western blot 檢測各組細(xì)胞PINK1、CD20、HDAC3、p-HDAC3 Ser424蛋白表達(dá)水平。提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白檢測試劑盒對其濃度進(jìn)行檢測，并放入-20℃環(huán)境下保存。將蛋白取出置于冰上復(fù)溫，復(fù)溫后先進(jìn)行30分鐘電泳，然后進(jìn)行90V恒牙電泳120分鐘，經(jīng)轉(zhuǎn)至PVDF膜后置于搖床，并采用封閉液進(jìn)行封閉，2小時后加一抗并于4℃環(huán)境下孵育過夜，次日取出經(jīng)TBST洗膜后3次，每次5分鐘，加二抗置于自然室溫下孵育2小時，取出經(jīng)TBST洗膜后3次，每次5分鐘，然后進(jìn)行顯色及條帶分析。分離sh-PINK1組、sh-Con組細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，采用western blot 檢測兩組細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中PINK1、p-HDAC3 Ser424、CD20蛋白表達(dá)水平。④取余下OCI-Ly7細(xì)胞系隨機(jī)分為DMSO組、RGFP966組、Con組，Con組細(xì)胞不作處理，而RGFP966組細(xì)胞采用10μM HDAC3特異性抑制劑RGFP966處理24小時，DMSO組細(xì)胞作抑制劑對照。采用western blot 檢測各組細(xì)胞CD20蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 PINK1對OCI-Ly7細(xì)胞CD20 mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響 Sh-PINK1組細(xì)胞PINK1mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組，CD20mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)。Sh-Con組細(xì)胞PINK1、CD20mRNA及蛋白表達(dá)水平與對照組相比差異無顯著性(P>0.05)，見表1、圖1。

表1 各組OCI-Ly7細(xì)胞PINK1、CD20 mRNA表達(dá)水平比較

圖1 各組OCI-Ly7細(xì)胞PINK1、CD20蛋白表達(dá)水平比較

2.2 PINK1對OCI-Ly7細(xì)胞HDAC3蛋白磷酸化的影響 Sh-PINK1組細(xì)胞p-HDAC3 Ser424蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組(P<0.05)。Sh-Con組細(xì)胞p-HDAC3 Ser424蛋白表達(dá)水平與對照組相比差異無顯著性(P>0.05)，見圖2。

圖2 各組OCI-Ly7細(xì)胞HDAC3、p-HDAC3 Ser424蛋白表達(dá)水平比較

2.3 PINK1低表達(dá)對PINK1、p-HDAC3 Ser424、CD20蛋白表達(dá)水平的影響 在細(xì)胞核中，sh-PINK1組PINK1、p-HDAC3 Ser424蛋白表達(dá)水平均低于對照組(P<0.05)。在細(xì)胞質(zhì)中，sh-PINK1組CD20蛋白表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組OCI-Ly7細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中PINK1、p-HDAC3 Ser424、CD20蛋白表達(dá)水平比較

2.4 HDAC3特異性抑制劑對OCI-Ly7細(xì)胞CD20蛋白表達(dá)的影響 RGFP966組OCI-Ly7細(xì)胞CD20蛋白表達(dá)水平顯著高于Con組(P<0.05)。Con組OCI-Ly7細(xì)胞CD20蛋白表達(dá)水平與DMSO組相比差異無顯著性(P>0.05)，見圖4。

圖4 各組OCI-Ly7細(xì)胞CD20蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

臨床研究證實，導(dǎo)致DLBCL患者預(yù)后不同的原因與其腫瘤分期、病理類型等因素相關(guān)。此外，癌基因發(fā)生突變、蛋白功能或信號途徑發(fā)生變化等亦可對其產(chǎn)生一定影響[10-11]。故探究誘發(fā)DLBCL起病及進(jìn)展的關(guān)鍵基因極為重要。

有研究證實，PINK1具有識別及降解受損線粒體的能力，可發(fā)揮線粒體質(zhì)量控制的作用[12]。但在神經(jīng)退行性疾病及癌癥中PINK1通常處于失調(diào)狀態(tài)。CD20是目前臨床治療B細(xì)胞惡性腫瘤的靶向藥物之一，臨床實踐顯示，利妥昔單抗是一種人/鼠嵌合型抗CD20單克隆抗體，經(jīng)其干預(yù)后大部分DLBCL患者臨床預(yù)后極差[13]。臨床研究顯示，PINK1及CD20 mRNA在DLBCL中的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)[14]。故我們推測，PINK1可能參與調(diào)控CD20在DLBCL細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。本次研究我們首先對各組細(xì)胞系中PINK1及CD20 mRNA及蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，Sh-PINK1組細(xì)胞PINK1mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組，CD20mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組。本研究結(jié)果證實，在DLBCL細(xì)胞系中，PINK1可通過參與調(diào)節(jié)CD20 mRNA轉(zhuǎn)錄進(jìn)而達(dá)到調(diào)控CD20表達(dá)的目的。有報道顯示，HDAC抑制劑具有促進(jìn)CD20表達(dá)，其主要是通過CD20轉(zhuǎn)錄實現(xiàn)的。另有文獻(xiàn)報道，在HDAC家族中，只有HDAC3可與PINK1相互作用，PINK1可促進(jìn)HDAC3的Ser424位點活化及功能；此外，HDAC3通常在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮去乙酰化作用，最終達(dá)到阻斷DNA轉(zhuǎn)錄的目的[15-16]。在本次研究中我們發(fā)現(xiàn)，Sh-PINK1組細(xì)胞p-HDAC3 Ser424蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組。我們將DLBCL細(xì)胞系質(zhì)核分離，并對其中PINK1、p-HDAC3 Ser424蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞核中，sh-PINK1組PINK1、p-HDAC3 Ser424蛋白表達(dá)水平均顯著低于對照組；在細(xì)胞質(zhì)中，sh-PINK1組CD20蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組。說明PINK1具有磷酸化細(xì)胞核內(nèi)HDAC3 Ser424位點的作用，然而HDAC3通常表達(dá)于細(xì)胞核，故增強(qiáng)HDAC3磷酸化的可能是細(xì)胞核內(nèi)的PINK1。HDAC抑制劑可阻斷HDAC去乙酰化功能，其在加速CD20啟動子核心組蛋白乙酰化的同時亦可提高轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合的能力，進(jìn)而加速CD20轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)[17-19]。臨床報道顯示，HDAC具有調(diào)節(jié)CD20轉(zhuǎn)錄的能力[20-22]。然而目前關(guān)于PINK3通過磷酸化HDAC3是否具有調(diào)控DLCL細(xì)胞CD20的能力還有待進(jìn)一步研究。因此本研究采用HDAC3特異性抑制劑對DCBCL細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，同時設(shè)置DMSO抑制劑對照組，并收集其蛋白對其中CD20蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，RGFP966組OCI-Ly7細(xì)胞CD20蛋白表達(dá)水平顯著高于Con組。說明HDAC3可作為調(diào)節(jié)CD20表達(dá)水平的關(guān)鍵蛋白。

4 結(jié)論

在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中，細(xì)胞核PINK1可磷酸化HDAC3的Ser424位點進(jìn)而激活HDAC3，最終達(dá)到轉(zhuǎn)錄抑制CD20表達(dá)的作用，而敲低PINK1表達(dá)或阻斷HDAC3表達(dá)可顯著促進(jìn)CD20表達(dá)。