TGFβ1/Smad3信號通路在帕瑞昔布鈉對CCI模型大鼠神經病理性疼痛影響中的作用

劉建輝 張幫建 李定海

(1.攀枝花市仁和區人民醫院麻醉科，四川 攀枝花 617061；2.攀枝花市中心醫院麻醉科，四川 攀枝花 617067)

神經病理性疼痛是以異常性疼痛、痛覺過敏和自發性疼痛為特征的一種慢性神經系統疾病，發病率約為3.3%～17.9%[1]。神經病理性疼痛主要是由物理性傷害、感染和自身免疫等因素引起的神經損傷或功能障礙導致，嚴重影響患者的健康和生活質量，且目前仍然缺乏有效的治療方法。研究發現，帕瑞昔布鈉是一種環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的高選擇性抑制劑，通過抑制花生四烯酸向前列腺素轉化，從而降低神經炎癥，對于神經病理性疼痛具有較好的緩解作用，但是其作用機制尚缺乏研究[2-3]。多項研究證實，轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGFβ1)可以有效的抑制小膠質細胞增殖和活化，下調神經炎癥水平[4-5]。因此，本研究認為TGFβ1及下游的Smad3信號通路可能通過抑制小膠質細胞介導的神經炎癥，從而在神經病理性疼痛中發揮負調節效應，并證實帕瑞昔布鈉通過激活TGFβ1/Smad3信號通路緩解大鼠神經病理性疼痛，為帕瑞昔布鈉的臨床治療提供了新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 SPF級健康雄性SD大鼠40只，8～12周齡，體重180～220g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。飼養條件：室內溫度22～24℃，相對濕度50%～60%，自然照明，自由飲食和飲水，定時更換墊料和籠具，適應性飼養1周。將SD大鼠按照隨機數字表法分為假手術組(SC組)、神經病理性疼痛組(CCI組)、帕瑞昔布鈉組(PAR組)、帕瑞昔布鈉+TGFβ1抑制劑1D11組(1D11組)4組，每組各10只。本研究對大鼠的處置符合動物倫理要求，并經醫院倫理委員會審核同意。

1.2 大鼠神經病理性疼痛模型的構建 參照文獻報道[6]通過慢性坐骨神經結扎(chronic sciatic nerve constriction injury，CCI)制備大鼠神經病理性疼痛模型。采用10%的水合氯醛腹腔注射誘導大鼠麻醉，俯臥位固定，剃去右大腿的毛發并消毒，沿股骨外側縱向切開皮膚，鈍性分離肌層，將坐骨神經主干游離出約7 mm，采用4-0鉻制腸線分別環扎4道，間隔約1 mm，結扎后可見小腿肌肉輕度顛動，將肌肉與皮膚逐層縫合。

1.3 各組處理方法 SC組僅游離坐骨神經，不進行結扎,CCI組、PAR組與1D11組均行神經病理性疼痛造模。PAR組在造模后給予10 mg/kg的帕瑞昔布鈉(4 mg/mL，美國Pfizer公司，批號85820012)腹腔注射，連續7天，給藥劑量與時間根據文獻報道與預實驗確定[3,7]。1D11組在造模后給予10 mg/kg的帕瑞昔布鈉與1 mg/kg的1D11(0.4 mg/mL，美國R&D Systems公司，MAB1835)腹腔注射，連續7天。SC組、CCI組則給予同體積的生理鹽水腹腔注射。

1.4 行為學檢測機械痛閾和熱痛閾 分別在術前1天(首次給藥前1天)、術后3天(首次給藥后3天)、術后7天(首次給藥后7天)、術后14天(首次給藥后14天)時，對各組大鼠的機械痛閾和熱痛閾進行檢測。①機械痛閾：將大鼠放置于金屬的網格籠子中30 min，使其適應實驗環境后，采用Electronic von Frey觸覺測痛儀(美國IITC公司，Series 2392)對大鼠的右足底中部進行刺激，當大鼠出現舔足、縮足、抬足等躲避動作時記錄刺激力度，即為機械痛閾，每只大鼠重復測量3次，每次間隔時間大于10 s，取平均值。②熱痛閾：將大鼠放置于透明的玻璃箱子中30 min，使其適應實驗環境后，采用熱測痛儀(美國IITC公司，Series 8)對大鼠的右足底中部進行照射，當大鼠出現舔足、縮足、抬足等躲避動作時記錄照射時間，即為熱痛閾，每只大鼠重復測量3次，每次間隔時間5 min，取平均值。

1.5 蛋白質免疫印跡檢測TGFβ1/Smad3信號通路的表達 在術后14d完成行為學檢測后，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉，將大鼠斷頭處死，分離手術側L4-6節段的脊髓背角組織。加入RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司，P0013)對組織進行勻漿，4℃下12000 r/min離心10 min，留取上清液，保存于-80℃冰箱。采用BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，P0012)測定蛋白濃度，取30 μg總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將目的蛋白電轉膜至PVDF膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4℃過夜孵育，抗體濃度分別為：兔抗鼠TGFβ1(1 μg/mL，英國Abcam公司，ab92486)、兔抗鼠p-Smad3(0.5 μg/mL，英國Abcam公司，ab52903)、兔抗鼠GAPDH(0.5 μg/mL，英國Abcam公司，ab9485)。次日，TBST洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(0.4 μg/mL，英國Abcam公司，ab6721)，室溫避光孵育1 h，ECL顯色后曝光拍照。使用Image Pro Plus 6.0軟件測定各條帶的灰度值，將對照組中目的蛋白與GAPDH的灰度值之比作為1。

1.6 免疫熒光染色檢測鈣離子接頭蛋白-1(Iba-1)蛋白的表達 采用4%的多聚甲醛對脊髓背角組織進行4℃過夜固定，再使用30%的蔗糖4℃過夜脫水。將樣本放入標本托中，加入OCT包埋劑(美國Sakura公司)，液氮速凍后，放入-80℃冰箱中保存。使用冰凍切片機對組織樣本進行連續切片，制作10 μm厚的冰凍切片，裱于防脫載玻片上。切片用PBS漂洗1次，然后用含有0.3% Triton X-100的5%山羊血清封閉液室溫孵育1 h，吸去血清，滴加兔抗鼠Iba-1抗體(6.32 μg/mL，英國Abcam公司，ab178847)4℃過夜孵育。PBS漂洗3次，滴加Alexa Fluor?488標記的山羊抗兔二抗(2 μg/mL，英國Abcam公司，ab150077)室溫避光孵育1 h，PBS漂洗3次，滴加含DAPI的抗熒光淬滅封片劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)進行封片，熒光顯微鏡下觀察和拍照。使用Image Pro Plus 6.0軟件測定各組Iba-1的熒光強度值，將對照組的熒光強度值作為1進行比較。

1.7 實時熒光定量PCR檢測炎癥因子的水平 使用TRIzol提取試劑(美國Invitrogen公司，15596018)從脊髓背角組織中提取總RNA，超微量分光光度計(美國Thermo公司，NanoDrop 2000)檢測RNA濃度及OD260/280(1.8～2.1)。使用SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System(美國Invitrogen公司，11904018)進行逆轉錄，反應條件：25℃，10 min；42℃，5 min；70℃，15 min；4℃。使用Fast SYBR Green Master Mix(美國Applied Biosystems公司，4385614)進行定量PCR，反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，循環40次；95℃，15 s；60℃，60 s；95℃，15 s。使用2-ΔΔCT法分析結果，引物合成于上海生工生物工程股份有限公司，具體序列，見表1。

表1 引物序列

2 結果

2.1 各組大鼠機械痛閾和熱痛閾的比較 各組大鼠在術前1d時機械痛閾與熱痛閾比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；與SC組相比較，CCI組在術后3d、7d、14d時機械痛閾與熱痛閾均降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)；與CCI組相比較，PAR組在術后3d、7d、14d時機械痛閾與熱痛閾均升高，差異均具有統計學意義(P<0.05)；與PAR組比較，1D11組在術后3d、7d、14d時機械痛閾與熱痛閾降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組大鼠機械痛閾和熱痛閾的比較

表2 各組大鼠機械痛閾和熱痛閾的比較

2.2 各組大鼠TGFβ1/Smad3信號通路表達水平的比較 SC組和CCI組脊髓背角組織中TGFβ1、p-Smad3表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；與CCI組相比較，PAR組脊髓背角組織中TGFβ1、p-Smad3表達水平升高，差異均具有統計學意義(P<0.05)；與PAR組比較，1D11組脊髓背角組織中TGFβ1、p-Smad3表達水平降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 蛋白質免疫印跡檢測TGFβ1/Smad3信號通路的表達

2.3 各組大鼠小膠質細胞活化程度的比較 與SC組相比較，CCI組脊髓背角組織中Iba-1熒光強度明顯增強；與CCI組相比較，PAR組脊髓背角組織中Iba-1熒光強度明顯減弱；與PAR組比較，1D11組脊髓背角組織中Iba-1熒光強度明顯增強，見圖3。

圖3 免疫熒光染色檢測Iba-1的表達(標尺：100 μm)

2.4 各組大鼠炎癥因子水平的比較 與SC組相比較，CCI組脊髓背角組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，差異均具有統計學意義(P<0.05)；與CCI組相比較，PAR組脊髓背角組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)；與PAR組比較，1D11組脊髓背角組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組大鼠炎癥因子水平的比較

3 討論

目前有幾種治療神經病理性疼痛的藥物，包括非甾體類抗炎藥、阿片類藥物、抗驚厥藥、抗抑郁藥等，但是將近三分之二的患者對這些治療均無反應，被認為具有治療抵抗力[8]。治療藥物研發的不理想與病理機制的復雜性密切相關[9-10]。中樞敏化是解釋疼痛誘發的主要機制，表現為突觸數量的升高及突觸傳遞的長時程增強[11]。近年來，學界認為小膠質細胞活化后向突觸間隙周圍遷移，通過分泌大量的神經炎癥因子，導致軸突末梢去極化，是引起中樞敏化的重要機制[12-13]。因此，從小膠質細胞介導神經炎癥的角度去深入挖掘神經病理性疼痛的關鍵機制，從而針對性的開發新型鎮痛藥，可能達到理想的治療效果。

作為一種COX-2抑制劑，帕瑞昔布鈉具有較好的炎癥抑制效應[14-15]。研究表明，它也對神經病理性疼痛具有較好的緩解作用，可抑制小膠質細胞和星形膠質細胞活化，降低脊髓組織中炎癥介質的表達[2-3]。本研究通過慢性坐骨神經結扎的方法構建了大鼠神經病理性疼痛模型，結果也證實了帕瑞昔布鈉的鎮痛及抗炎效應。但是，帕瑞昔布鈉除了抑制COX-2表達外，是否還通過其他作用機制發揮治療效應也有待研究。

眾所周知，TGFβ1是一種多功能的細胞因子，參與調節細胞增殖、凋亡、分化、遷移等多種功能，而在免疫調節中卻發揮負性效應，例如TGFβ1功能減弱導致淋巴細胞過度激活是系統性紅斑狼瘡的主要發病機制[16]。早期有研究發現，在正常的成年個體中，TGFβ2和β3在神經系統中的神經元和神經膠質細胞中普遍表達，而TGFβ1卻僅限于腦膜[17]。然而隨后的研究發現，患有神經退行性疾病或缺血性損傷的動物大腦中TGFβ1表達水平顯著上調[18-19]。近年通過體內體外研究發現，TGFβ1對神經元和神經膠質細胞具有一系列的生物學功能，例如TGFβ1可以與膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)等其他營養因子協同作用，調節神經元的存活[20]；可以抑制小膠質細胞的增殖，降低自由基含量，發揮抗炎和免疫抑制效應[4,21]。由此，本研究提出TGFβ1是否通過抑制小膠質細胞介導的神經炎癥，從而在神經病理性疼痛中發揮負調節效應，是否參與帕瑞昔布鈉的抗炎與鎮痛機制。

本研究結果顯示，雖然造模后TGFβ1的表達水平并未發生顯著性變化，但是帕瑞昔布鈉給藥卻可以明顯上調TGFβ1的表達，而給予TGFβ1抑制劑1D11則可抑制其表達上調。TGFβ1通過與II型跨膜絲氨酸蘇氨酸激酶受體(TGFβRII)結合而發出信號，進而激活I型受體(TGFβRI)，使下游Smad3發生磷酸化，進而轉位至細胞核內調節基因表達，因此p-Smad3是TGFβ1信號的主要介導者[22-23]。本文結果顯示，p-Smad3的表達趨勢與上述TGFβ1相一致，證實了1D11可以有效抑制帕瑞昔布鈉對TGFβ1/Smad3信號通路的激活。進一步的實驗結果表明，1D11可以逆轉帕瑞昔布鈉的鎮痛及抗炎效應，證實了TGFβ1/Smad3信號通路在帕瑞昔布鈉保護機制中的重要作用。但是，1D11對帕瑞昔布鈉的鎮痛及抗炎效應僅表現為部分抑制，卻不能完全阻斷，提示可能還有其他病理機制在發揮作用，未來仍待進一步研究。

4 結論

本文闡釋了TGFβ1/Smad3信號通路在帕瑞昔布鈉治療大鼠神經病理性疼痛中發揮著重要作用，為帕瑞昔布鈉的臨床治療提供了新的理論基礎。此外，TGFβ1/Smad3信號通路可能單獨作為治療靶點，用于開發新型藥物，可能具有更大的應用價值。