非小細胞肺癌組織中肥胖基因FTO的表達水平及其對腫瘤細胞血管生成的影響*

潘華琴 陳燕華 應海玲 顧藝難

(1.泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300；2.南通大學醫(yī)學院，江蘇 南通 226019)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是全球癌癥死亡的主要原因之一[1-2]。我國肺癌的發(fā)生率逐年升高，盡管進行了數(shù)十年的努力以治療這種惡性疾病，但是肺癌的預后仍然不利，晚期NSCLC尤為顯著[3]，因此需不斷探索其發(fā)生發(fā)展機制，研究新的有效的診斷和治療方法[4]。過去十年的研究中，人們對肺癌基因組和信號通路的深入分析進一步將NSCLC定義為一種具有遺傳和細胞異質性的獨特疾病[5]。人們利用通過微創(chuàng)技術獲得的較小樣本，病開發(fā)分子檢測用來鑒定可用于臨床診斷的遺傳變異，但是工作仍然繁重[6]。因此，分子和細胞機制的探究仍然是明晰肺癌生長和發(fā)展規(guī)律的重要手段。脂肪和肥胖相關蛋白(FTO)或稱為依賴酮戊二酸的雙加氧酶，是一種在人類中由FTO基因編碼的酶[7]。已在包括哺乳動物在內的大多數(shù)真核生物中發(fā)現(xiàn)mRNA可被N6-甲基腺苷(m6A)廣泛修飾[8-9]。FTO基因在胎兒和成人組織中豐富表達，而且有效地使含有RNA的m6A去甲基化[10-11]。通過使目標mRNA脫甲基，F(xiàn)TO參與了多種生理和病理過程，包括肥胖[12]、糖尿病[13]、組織分化和癌癥[14]。例如，F(xiàn)TO作為N6-甲基腺苷RNA脫甲基酶在急性髓細胞白血病中起著致癌作用[15]。但FTO在人類NSCLC中的作用仍然未知。研究顯示，人NSCLC組織中FTO的mRNA的水平上調[16-17]。而且敲低FTO與肝內膽管細胞癌的血管生成和腫瘤微血管密度相關[18]。本研究觀察了NSCLC患者肺癌組織與鄰近癌旁組織中FTO的表達以及敲低FTO對NSCLC細胞血管生成的影響,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 納入2019年1～12月在我院治療的45例NSCLC患者。其中包括31例男性和14例女性，平均年齡59.8歲，TNM分期：Ⅰ期患者15例，Ⅱ～Ⅲ 期21例，Ⅳ期9例。腫瘤在組織學上分為22例腺癌和23例鱗狀細胞癌。肺癌的診斷是根據(jù)世界衛(wèi)生組織的形態(tài)學標準確定的。本研究經我院的醫(yī)學倫理委員會審核通過，并經過患者和家屬的知情同意。收集手術中留存的癌組織以及癌旁組織標本，保存于-80℃。

1.2 實時定量PCR(RT-qPCR) 使用TRIzol(美國Thermo公司)從NSCLC組織或細胞中提取總RNA。用一步RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)對1 μg的總RNA進行合成第一鏈cDNA。在ABI-7500 RT-PCR系統(tǒng)上使用GE Green Ⅱ(日本TaKaRa公司)進行qPCR檢測。Tubulin基因被用作內參因。本研究中使用的引物如下：FTO forward: 5′-ACTTGGCTC CCTTATCTGACC-3′ FTO reverse: 5′-TGTGCAG TGTGAGAAAGGCTT-3′；Tubulin forward: 5′-CC AACCTGATGGGCATTGAGT-3′；Tubulin reverse: 5′-CGGCATGTAGAAGAAGGGTG-3′。

1.3 蛋白免疫印跡 在RIPA裂解緩沖液(上海碧云天公司)中裂解肺組織，NSCLC組織和培養(yǎng)的細胞。40 mg蛋白質進行SDS-PAGE分離，并將蛋白質轉移到PVDF膜(美國Millipore)上，在TBST黃油中洗滌膜，在5%無脂牛奶中封閉1 h。然后將膜與特異性一抗在4℃孵育過夜。在該研究中使用了以下一級抗體：抗FTO抗體(美國Cell Signaling Technology公司，14386)和抗Tubulin抗體(美國Cell Signaling Technology公司，5335)。然后洗滌轉印膜，與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗山羊抗兔IgG H&L(美國Abcam公司，ab6721)或兔抗山羊IgG H&L(美國Abcam公司，ab6741)孵育。信號由化學發(fā)光底物(美國Thermo Scientific公司，34080)檢測，并使用Blue Devil放射自顯影膠片進行顯影。

1.4 細胞培養(yǎng) 從美國ATCC購買獲得人肺癌細胞株A549、LC-AI、NCIeH1882、NCIeH466、HCIeH522和人小氣道上皮細胞(人氣道上皮細胞HSAEC)。將細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(Gibco)、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的高糖DMEM(Gibco)中。所有細胞在37℃，含5% CO2的濕化氣氛下培養(yǎng)。

1.5 慢病毒包裝 制備攜帶短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)的慢病毒，用以敲除FTO。對照sh-NC、sh-FTO的逆轉錄病毒顆粒購于美國Sigma公司。shRNA序列為：shFTO-1#: 5′-GCAGCTG AAATATCCTAAACT-3′, shFTO-2#: 5′-GCTGA AATAGCCGCTGCTTGT-3′。并將shRNA和肺癌細胞一起孵育 24 h。

1.6 體外細胞增殖測定 按照制造商說明書，使用CCK-8細胞增殖測定試劑盒(美國R&D SYSTEMS公司)檢測細胞增殖。

1.7 荷瘤實驗 實驗體內腫瘤移植實驗參考之前的研究[19]。在收獲后的30 min內，在4至6 w齡的雄性小鼠的左右兩側皮下注射相同數(shù)量的sh-NC或sh-FTO的A549細胞。在實驗結束時(4 w)測量腫瘤重量，每五天定量腫瘤體積。

1.8 小管形成實驗 在37℃的條件下，將50 μL的熒光素(購于美國BD Biosciences,公司)溶解基質在孔中孵育0.5 h。將各組A549細胞(2×104/孔)接種于96孔板中，使用溶解基質。觀察管狀結構，并在顯微鏡下(德國 萊卡)拍攝。

1.9 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計學分析，如果沒有另外的信息，所有值均表示為至少三個獨立實驗的mean±SEM。使用t檢驗或單向方差分析確定各組之間的統(tǒng)計差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FTO在人非小細胞肺癌組織中的表達 檢測FTO在人肺癌組織中的表達。與癌旁組(10.23±2.06)相比，NSCLC組(14.61±1.71)中FTO的mRNA水平上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，(圖1A、1B)。此外，蛋白免疫印跡分析得出癌旁非癌組織和肺癌組織的相對表達量分別為(1.00±0.12)和(2.02±0.19)，與癌旁組比，NSCLC組中FTO的蛋白水平上調(P<0.01)，見圖1C、1D。

圖1 FTO在非小細胞肺癌組織中的mRNA和蛋白的表達

2.2 FTO在肺癌細胞中的表達 檢測正常人肺上皮細胞(HSAEC)和肺癌細胞系(NCIeH1992、NCIeH446、NCIeH566、A549、LCAI)中FTO的mRNA水平分別為(1.00±0.03)、(2.43±0.04)、(3.17±0.08)、(1.45±0.05)、(2.03±0.05)、(3.52±0.12)。結果顯示，與HSAEC相比，肺癌細胞中FTO的mRNA和蛋白水平均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 FTO在肺癌細胞中的mRNA和蛋白的表達

2.3 敲低FTO在體外抑制肺癌細胞的生長 為了研究FTO在人肺癌中的功能，我們用慢病毒介導的shRNA敲低肺癌細胞A549和LC-AI后的FTO表達，其中A549細胞的sh-NC組、sh-FTO#1組、sh-FTO#2組的相對表達分別為(1.00±0.08)、(0.19±0.03)、(0.12±0.06)；sh-FTO#1組和sh-FTO#2組的表達均低于sh-NC(均P<0.01)；LC-AI細胞的sh-NC組、sh-FTO#1組、和sh-FTO#2組的相對表達分別為(1.00±0.02)、(0.07±0.02)、(0.06±0.01)；sh-FTO#1組和sh-FTO#2組的均低于sh-NC(均P<0.01)，見圖3A。分析了敲低FTO對細胞增殖的影響。其中LC-AI細胞的sh-NC組、sh-FTO#1組、sh-FTO#2組中的相對CCK8值分別為(9.83±1.02)、(4.20±0.38)、(4.51±0.30)，sh-FTO#1組和sh-FTO#2組的相對CCK8值均低于sh-NC組(均P<0.01)；A549細胞的sh-NC組、sh-FTO#1組、sh-FTO#2組中的相對CCK8值分別為(8.72±3.20)、(4.31±0.18)、(4.73±0.22)，sh-FTO#1組和sh-FTO#2組的相對CCK8值均低于sh-NC組(均P<0.01)，見圖3B、3C。結果表明，敲低FTO抑制了人肺癌細胞的體外增殖，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 敲低FTO對肺癌細胞增殖的影響

2.4 敲低FTO抑制體內肺癌腫瘤生長 另外，將具有FTO穩(wěn)定敲低的A549細胞進行小鼠體內癌細胞生長測定的體內異種移植實驗。我們最終分析了從裸鼠分離出的腫瘤的腫瘤重量。結果顯示，sh-FTO#1組、sh-FTO#2組的腫瘤體積均低于sh-NC組(均P<0.01)。sh-NC組、sh-FTO#1組、sh-FTO#2組的腫瘤質量分別為(1.05±0.34)g、(0.51±0.19)g、(0.70±0.22)g，sh-FTO#1組和sh-FTO#2組的腫瘤質量均低于sh-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。表明FTO敲除抑制了A549細胞的體內生長,見圖4。

圖4 FTO對裸鼠體內肺癌腫瘤生長的影響

2.5 FTO在體外抑制NSCLC的小管生成 探討了敲低FTO是否抑制NSCLC的小管生成。sh-NC組、sh-FTO#1組、sh-FTO#2組的小管相對長度分別為(1.00±0.01)、(0.47±0.07)、(0.52±0.02)，sh-FTO#1組和sh-FTO#2組的小管相對長度均低于shNC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見5。

3 討論

本研究觀察到FTO在NSCLC組織和多個肺癌細胞系中的表達明顯升高，在體外對FTO進行敲低后觀察到NSCLC細胞的增殖率降低，且對NSCLC細胞的血管生成能力和遷移率有明顯抑制作用。本研究表明FTO是極為有潛力的血管生成相關的基因。

圖5 FTO對體外A549細胞的小管形成影響結果

近年來的FTO的基因多態(tài)性研究顯示FTO的SNP(包括rs9939609、rs17817449、rs8050136、rs1477196、rs6499640、rs16953002、rs11075995、rs1121980)和超重/肥胖及多種類型的癌癥(包括乳腺癌、前列腺癌、腎癌、子宮內膜癌、胰腺癌、淋巴瘤和白血病)的風險增加密切相關[20-21]。而且，F(xiàn)TO內含子中的SNP都與乳腺癌風險顯著相關[22]。值得注意的是，F(xiàn)TO內含子之外的SNP也可能與癌癥風險相關FTO內含子與黑色素瘤風險顯著相關[21]。最近研究表明，F(xiàn)TO在多種癌癥中過度表達也發(fā)揮致癌作用[23-24]，如白血病，腦腫瘤，乳腺癌，胃癌和宮頸鱗狀細胞癌[22,25-28]。Li等在體內動物模型研究證明了FTO在癌癥中的關鍵致癌作用，其中FTO在某些急性髓性白血病(AML)的亞型中高表達，強制表達FTO明顯促進人AML細胞的存活和增殖，并抑制人類AML細胞的分化和凋亡，而強制表達FTO顯著促進小鼠的白血病發(fā)生[29]。然而到目前為止鮮見FTO在NSCLC中的研究報道，本研究觀察了45例NSCLC患者的癌組織和臨近非癌組織中FTO的表達。結果表明，在NSCLC中FTO無論在mRNA水平還是蛋白水平，均比臨近的非癌組織中高表達。另外，本研究利用五種肺癌細胞系A549、LC-AI、NCIeH1882、NCIeH466、HCIeH522，觀察其與正常人小氣道上皮細胞(人氣道上皮細胞HSAEC)FTO mRNA和蛋白的表達變化，結果顯示FTO在肺癌細胞中的表達高于HSAEC。由于FTO表達與腫瘤的關系，研究一致顯示FTO高表達與腫瘤發(fā)展相關[23]。因此本實驗結果的非小細胞肺癌中FTO高表達可能與非小細胞肺癌的發(fā)展同樣有關。

有研究顯示，敲低FTO可以顯著增強人急性髓細胞性白血病AML細胞對全反式維甲酸的反應，并促進ATRA誘導的AML細胞分化[30]。R-2HG處理還使人AML細胞對體外標準化療藥物(如ATRA，阿扎胞苷，地西他濱和柔紅霉素)的敏感性增強[30]。與FTO在耐藥性中的作用相一致，F(xiàn)TO的過度表達是胃癌和子宮內膜癌等癌癥預后不良的標志[27-28]。本研究使用shRNA在兩個肺癌細胞系中敲低FTO，觀察到FTO敲低可以明顯抑制腫瘤細胞的增殖能力，并抑制腫瘤細胞在體內的生長。表明在非小細胞肺癌中FTO可能是一個潛在的治療靶點。

人們在多種癌癥類型中都觀察到了血管生長和新的血管形成[31-32]。該過程取決于調節(jié)血管生成的因子并可能影響癌癥侵襲性[33]。而且當內源性FTO的表達減少時，腫瘤細胞的增殖、侵襲被抑制[30]。Cui等[34]發(fā)現(xiàn)在小鼠中用FTO抑制劑靶向膠質母細胞瘤干細胞樣細胞可以顯著抑制體內由GSC引發(fā)的腫瘤發(fā)展。也有報道顯示FTO表達的減少顯著抑制人胃癌細胞系的細胞增殖，遷移和侵襲，當強制表達FTO時觀察到相反的現(xiàn)象[35]。甚至FTO已被報道可參與促進腫瘤中的血管新生[17]，但是在其他腫瘤中的報道較少。而多數(shù)研究證實FTO可以抑制肺癌細胞的體外侵襲現(xiàn)象[36]。我們推測FTO可能會影響非小細胞肺癌的血管生成能力。本研究體外敲低FTO后，A549細胞的小管形成的長度降低了近50%，證實敲低FTO可抑制非小細胞肺癌細胞的血管生成能力。表明FTO的表達模式可能影響腫瘤的血管生長，仍需更多的體內實驗進行證實。

4 結論

FTO在NSCLC組織中的表達高于癌旁組織。低表達FTO通過抑制增殖和血管新生影響NSCLC的發(fā)生和發(fā)展。