基于SIRT1/ROR-γt通路探討白藜蘆醇對銅綠假單胞菌誘導(dǎo)的免疫抑制肺炎小鼠的治療作用*

羅勁松 夏利平 劉宏

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)又稱綠膿桿菌，屬于假單胞菌屬，是醫(yī)院獲得性感染和肺部感染的主要致病菌之一[1]。銅綠假單胞菌耐藥性強(qiáng)，耐藥譜廣，感染后難以清除，易形成慢性感染，為臨床治療帶來巨大困難。沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1(silent information regulator protein 1，SIRT1)屬于煙酰腺嘌呤二核苷酸(nicotinemide adenine dinucleotide，NAD+)依賴的類組蛋白去乙酰化酶[2]。SIRT1通過去乙酰化調(diào)節(jié)下游通路，在炎癥、細(xì)胞存活等過程中發(fā)揮重要作用[3]。核孤兒受體-γt(ROR-γt)與炎癥有關(guān)，當(dāng)ROR-γt缺陷時，組織浸潤和募集炎癥細(xì)胞能力降低，炎癥性疾病癥狀減輕[4]。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是最初從藜蘆花中分離得到的酚類物質(zhì)，存在于葡萄、虎杖、花生、桑葚等植物，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理學(xué)作用[5-7]。據(jù)研究，白藜蘆醇可通過調(diào)節(jié)SIRT1介導(dǎo)的信號通路參與抗炎反應(yīng)的保護(hù)因子[8]。魏晶等[9]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能夠促進(jìn)哮喘幼鼠肺組織中SIRT1的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)。但目前關(guān)于白藜蘆醇對免疫抑制肺炎小鼠的治療作用與SIRT1表達(dá)是否有關(guān)，尚未見相關(guān)報道。本研究通過建立銅綠假單胞菌誘導(dǎo)的免疫抑制肺炎小鼠模型，探究白藜蘆醇的藥效作用以及與SIRT1/RORγt通路的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 8周齡雌性BALB/c小鼠，體重25～35g，購自廣州醫(yī)科大學(xué)，許可證號：SYXK(粵)2020-0227，實(shí)驗遵守3R原則。

1.2 主要試劑 白藜蘆醇(>98%，批號：ZL2017851 42144，東明格魯斯生物科技有限公司)。環(huán)磷酰胺(CTX)(批號：18022625，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司)。IL-17 ELISA試劑盒(ab100702)，SIRT1(ab54334)、ROR-γt(ab268112)、DAPDH(ab222428)一抗及二抗(貨號：ab150077)購自英國Abcam公司。伊紅蘇木精試劑盒(貨號：C0105)、蛋白提取試劑盒(貨號：P0028)、BCA試劑盒(貨號：P0012)購自上海碧云天公司。總RNA提取試劑盒(DP431)購自北京天根生化科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR023A)、熒光定量PCR試劑盒(RR086A)購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.3 實(shí)驗儀器 熒光定量PCR儀和電泳儀購自美國Bio-Rad公司，轉(zhuǎn)膜儀購自美國Invitrogen公司，凝膠成像儀購自杭州Miulab公司，光學(xué)顯微鏡購自德國Leica公司。

1.4 方法

1.4.1 銅綠假單胞菌肺炎小鼠動物模型建立及動物分組 將90只小鼠隨機(jī)分為空白組、PA組、免疫抑制組、免疫抑制+PA組及免疫抑制+PA+白藜蘆醇組(依次命名為A、B、C、D、E組)，每組各18只。所有動物均飼養(yǎng)于無菌動物房，給予無菌飼料及無菌水喂養(yǎng)。經(jīng)過一周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，如先前所述[10]，經(jīng)過一定修改后于實(shí)驗第1、3、5天腹腔注射環(huán)磷酰胺150mg/kg，建立免疫抑制模型，對照組腹腔注射等量無菌PBS液。于實(shí)驗第6天，在小鼠每側(cè)鼻孔滴入10μL PA懸液(1×109CFU/mL)，將小鼠豎立30s左右，保證菌液在肺部均勻分布，建立PA模型(對照組給予等量無菌PBS液)。二者結(jié)合建立免疫抑制+PA模型。根據(jù)李明等[11]研究結(jié)果，使用無菌生理鹽水將白藜蘆醇配置成25μmol/L的濃度，在免疫抑制+PA模型建立后立即以10mL/kg白藜蘆醇的劑量腹腔注射，即為免疫抑制+PA+白藜蘆醇組。本研究符合動物倫理要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.4.2 樣本采集 各組小鼠于造模成功后4、8及24h后分批處死，每組每個時間點(diǎn)隨機(jī)選取6只。小鼠經(jīng)過量麻醉后處死，經(jīng)眼眶收集外周血1mL左右，離心收集血清，置于-80℃中保存?zhèn)溆谩Ｍ暾〕鲂∈蠓谓M織，左肺置于甲醛中固定，右肺液氮速凍后，置于-80℃中保存。

1.4.3 外周血IL-17濃度檢測 取各個時間點(diǎn)的凍存血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-17濃度，每個標(biāo)本設(shè)置3個復(fù)孔，酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度(OD450)，取平均值。

1.4.4 肺組織病理學(xué)檢測及評分 取出各個時間點(diǎn)固定在甲醛中的小鼠肺組織，經(jīng)過包埋、切片，HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)變化，并根據(jù)急性肺損傷評分標(biāo)準(zhǔn)，從肺內(nèi)毛細(xì)血管淤血、肺泡腔纖維蛋白滲出、中性粒細(xì)胞浸潤、氣道黏膜上皮脫落、肺泡間隔增寬等5方面，按病變程度分為5級評分，0分：無，1分：可疑，2分：輕度，3分：明顯，4分：重度改變。

1.4.5 qRT-PCR檢測SIRT1、RORγt mRNA表達(dá)水平 用Trizol法提取24h時間點(diǎn)各組小鼠肺組織總RNA，使用Nanodrop檢測RNA濃度及純度，然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR檢測。使用primer premier 5.0軟件設(shè)計熒光定量PCR引物(表1)，并由上海生工生物工程有限公司合成。qRT-PCR的反應(yīng)條件：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s，共40個循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。其中，以GADPH為內(nèi)參基因。

表1 SIRT1、RORγt、GADPH引物序列

1.4.6 Western blot法檢測SIRT1、RORγt蛋白表達(dá)水平 選取24h時間點(diǎn)各組小鼠，提取肺組織總蛋白，Western blot檢測SIRT1、RORγt蛋白表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對外周血IL-17濃度的影響 在同一時間進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各個時間點(diǎn)，與空白組相比，PA組和免疫抑制組小鼠血清中IL-17含量均顯著升高(P<0.05)；與免疫抑制組相比，免疫抑制+PA組小鼠血清中IL-17含量均顯著升高(P<0.05)；與免疫抑制+PA組相比，免疫抑制+PA+白藜蘆醇組血清中IL-17含量均顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 血清中IL-17檢測結(jié)果

2.2 白藜蘆醇對肺組織病理學(xué)的影響 HE染色后，光學(xué)顯微鏡下可觀察到，空白組各時間點(diǎn)肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)無明顯滲出物和炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔均一，無出血和水腫。免疫抑制組肺泡結(jié)構(gòu)較為完整，部分有少許炎性細(xì)胞浸潤。PA組和免疫抑制+PA組肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡內(nèi)可見大量中性粒細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)水腫，肺泡隔增厚，增寬。白藜蘆醇處理組肺組織的病理癥狀減輕，且隨著時間的增加，癥狀越來越輕，見圖1。

圖1 24h時間點(diǎn)小鼠肺組織HE染色結(jié)果(100×)

2.3 白藜蘆醇對肺組織病理學(xué)評分的影響 與空白組相比，PA組和免疫抑制組小鼠肺組織病理學(xué)評分顯著升高(P<0.05)；與免疫抑制組相比，免疫抑制+PA組小鼠肺組織病理學(xué)評分顯著升高(P<0.05)；與免疫抑制+PA組相比，免疫抑制+PA+白藜蘆醇組肺組織病理學(xué)評分顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組小鼠肺組織病理學(xué)評分

2.4 白藜蘆醇對SIRT1、RORγt mRNA表達(dá)水平的影響 造模成功后24h，與空白組相比，PA組和免疫抑制組小鼠肺組織RORγt mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，SIRT1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與免疫抑制組相比，免疫抑制+PA組小鼠肺組織RORγt mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，SIRT1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與免疫抑制+PA組相比，免疫抑制+PA+白藜蘆醇組肺組織RORγt mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，SIRT1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見表4。

表4 24h時間點(diǎn)各組小鼠SIRT1、RORγt mRNA表達(dá)水平

2.5 白藜蘆醇對SIRT1、RORγt蛋白表達(dá)水平的影響 造模成功后24h，與空白組相比，PA組和免疫抑制組小鼠肺組織RORγt蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，SIRT1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與免疫抑制組相比，免疫抑制+PA組小鼠肺組織RORγt蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，SIRT1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與免疫抑制+PA組相比，免疫抑制+PA+白藜蘆醇組肺組織RORγt蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，SIRT1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖2、表5。

表5 24h時間點(diǎn)各組小鼠SIRT1、RORγt蛋白表達(dá)水平

圖2 24h時間點(diǎn)各組小鼠SIRT1、RORγt蛋白WB檢測結(jié)果

3 討論

PA是引起醫(yī)院獲得性肺炎最常見的革蘭氏陰性菌之一[12]，生長繁殖所需營養(yǎng)條件低，抵抗力強(qiáng)，耐藥性強(qiáng)。當(dāng)PA感染機(jī)體后，機(jī)體會啟動自身免疫機(jī)制，釋放相應(yīng)的炎癥介質(zhì)，促進(jìn)機(jī)體的炎癥和損傷。TH17細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的一類CD4+T細(xì)胞亞群，能通過分泌IL-17等細(xì)胞炎癥因子激活機(jī)體炎癥反應(yīng)[13-14]。IL-17作為Th17細(xì)胞特異性細(xì)胞分子，通過結(jié)合Act1、TRAF6等受體而促進(jìn)多種趨化因子及基質(zhì)蛋白分泌，招募大量中性粒細(xì)胞聚集，引起炎性反應(yīng)，導(dǎo)致組織器官的炎性損傷[15-16]。環(huán)磷酰胺為臨床上常用免疫抑制藥物，能夠影響機(jī)體免疫反應(yīng)，造成機(jī)體免疫功能低下。本研究使用環(huán)磷酰胺制備免疫抑制小鼠模型，并在此基礎(chǔ)上制備PA感染肺炎模型，可觀察到肺炎小鼠毛發(fā)紊亂，行動緩慢，反應(yīng)遲鈍，呼吸急促，采食量減少，鏡下可見PA組和免疫抑制+PA組小鼠肺組織損傷嚴(yán)重，肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，同時大量中性粒細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁增寬、充血，小鼠肺組織病理學(xué)評分及血清中IL-17的含量顯著升高，表明PA感染免疫抑制小鼠，小鼠肺組織的病理變化嚴(yán)重，炎癥反應(yīng)明顯，揭示小鼠模型建立成功。

白藜蘆醇是一種天然植物多酚，具有廣泛的藥理活性，在抗炎癥方面效果顯著。黃曉軍等[17]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可降低急性肺損傷模型小鼠血清中促炎癥介質(zhì)水平，從而減輕急性肺損傷的炎癥程度。李明等[11]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以抑制呼吸道合胞病毒所致的信號通路激活，從而減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對肺損傷的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，PA誘導(dǎo)的免疫抑制肺炎小鼠經(jīng)白藜蘆醇處理后，小鼠肺組織病理癥狀減輕，中性粒細(xì)胞和炎性細(xì)胞減少，肺組織病理學(xué)評分和血清中IL-17的含量顯著降低，且隨著時間增加，癥狀減輕更明顯，表明白藜蘆醇可減輕PA誘導(dǎo)的免疫抑制肺炎小鼠的肺組織病變，減輕炎癥反應(yīng)，且隨著時間的增加，效果更顯著。

SIRT1為廣泛存在于哺乳動物NAD+依賴的去乙酰化酶，與炎癥反應(yīng)有關(guān)。RORγt是TH17細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，抑制RORγt表達(dá)可直接抑制未致敏T細(xì)胞向TH17細(xì)胞分化，進(jìn)而降低TH17細(xì)胞水平，減輕炎癥反應(yīng)[18-19]。本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，免疫抑制+PA組小鼠肺組織RORγt mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，SIRT1mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明上調(diào)RORγt蛋白，下調(diào)SIRT1蛋白，可能與小鼠炎癥反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)，加劇小鼠肺組織損傷。白藜蘆醇為去乙酰化酶SIRT1最有效的激活劑之一，具有明顯促進(jìn)SIRT1激活作用[20]。李傳文等[21]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇使SIRT1激活可促進(jìn)腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能缺損恢復(fù)，減輕炎癥反應(yīng)。李方等[8]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可明顯提高大鼠腎組織SIRT1蛋白表達(dá)水平，減輕炎癥反應(yīng)。本研究中，免疫抑制+PA組小鼠經(jīng)過白藜蘆醇處理后，RORγt的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，SIRT1mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明白藜蘆醇可促進(jìn)SIRT1表達(dá)，抑制RORγt表達(dá)，進(jìn)而抑制未致敏T細(xì)胞向TH17細(xì)胞分化，降低TH17細(xì)胞水平，減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇可能通過上調(diào)SIRT1表達(dá)，下調(diào)RORγt表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，減輕銅綠假單胞菌免疫抑制肺炎小鼠肺組織損傷，保護(hù)肺組織，為臨床治療PA肺炎提供了新思路，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。