氧糖剝奪對小鼠小膠質細胞NKG2D受體及其配體表達的影響*

劉琳 李晶瑩 曹麗麗 杜俊蓉

(1.四川大學華西藥學院，四川 成都 610041；2.成都大學基礎醫學院，四川 成都 610106)

小膠質細胞是大腦神經系統的固有免疫細胞。在腦缺血發生后，小膠質細胞迅速向損傷部位遷移，通過釋放炎性介質加重神經炎癥，進一步加重缺血后的腦損傷[1-2]。大量研究表明，小膠質細胞的過度激活在腦缺血炎癥反應中發揮關鍵作用[3-4]。但是，目前基于神經炎癥的干預策略均未能實現臨床轉化。自然殺傷細胞活化受體(Natural killer group 2 member D，NKG2D)是C型凝集素樣受體NKG2家族的重要成員，主要表達于NK 細胞、NKT 細胞、CD8+αβT 及部分γδ T等多種免疫細胞[5-6]。NKG2D可識別多種配體，這些配體屬于主要組織相容性復合體I類分子相關蛋白(MHC-Ⅰ)以及另一類MHC-I類相關分子ULBP[7-8]。研究表明，NKG2D配體是參與各種炎癥反應的應激誘導分子[9]。感染或炎癥刺激上調NKG2D配體表達，與NKG2D結合后，通過接頭蛋白DAP10傳遞活化信號，激活下游PI3K和GRB2進而引發免疫炎癥反應[10-11]。但是，目前尚未見NKG2D與腦缺血后小膠質細胞炎癥反應的相關性報道。氧葡萄糖剝奪(Oxygen-glucose deprivation，OGD)是體外誘導缺血性損傷的常用模型[12]。本實驗通過建立小鼠海馬HT22 神經元細胞OGD模型，進一步檢測HT22-OGD上清刺激小鼠BV2小膠質細胞后NKG2D信號通路的變化和炎癥反應，以探究NKG2D在腦缺血后小膠質細胞炎癥反應中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 小鼠海馬神經元HT22細胞系、BV2小膠質細胞系(廣州吉妮歐生物科技有限公司)，DMEM培養基、Cell Counting Kit-8試劑(Wako)，TNF-α小鼠ELISA 試劑盒(達科為生物技術有限公司)。iMark 酶標儀(Bio-Rad)，BDS200 倒置生物顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限責任公司)，Micro Drop 超微量分光光度計(BIO-DL)，LightCycler?96實時熒光定量PCR儀(Roche)。

1.2 方法

1.2.1 細胞OGD模型建立 HT22、BV2細胞常規培養于DMEM完全培養基，培養條件為5%CO2、37℃。HT22細胞棄原培養加入無糖DMEM培養基，95%N2 和 5%CO2、37℃條件培養19小時，復氧復糖24小時后收集HT22上清(OGD conditioned medium, OGD CM)，正常條件下培養上清(Normal CM)作為對照組。將BV2細胞分為Model組和Control組，分別用 OGD CM和Normal CM進行刺激。HT22、BV2細胞分別接種于96孔板，經造模處理后，每孔加入10 μL CCK8 溶液，繼續培養1小時后于450 nm波長處測定吸光度(OD)值，按公式計算細胞存活率：OD sample/OD control mean×100%。

1.2.2 ELISA法測定促炎因子含量 分別收集HT22神經元細胞的Normal CM和OGD CM刺激BV2細胞后的培養基上清，3500r/min 離心15分鐘后收集上清，按照ELISA試劑盒說明書，檢測TNF-α含量。

1.2.3 qPCR測定NKG2D受體信號通路及炎癥產物的mRNA水平 采用Trizol試劑提取BV2細胞RNA，逆轉錄為cDNA后用于qPCR測定NKG2D、H60、MULT1、RAE-1、DAP10及炎癥產物TNF-α的mRNA水平表達量，并歸一化為GAPDH，使用 2-ΔΔCT方法來分析目的基因的 mRNA 相對表達水平。參照文獻設計PCR引物序列[13-17]，見表1。

表1 定量PCR引物序列

2 結果

2.1 OGD對HT22以及OGD CM對BV2細胞活力的影響 與HT22-Control組相比，OGD 19小時后HT22-Model組細胞活力明顯降低(P<0.01)，表明氧糖剝奪對神經元細胞造成明顯的損傷。與BV2-Control組相比，BV2-Model組細胞活力無明顯變化(P>0.05)，表明HT22 OGD CM不會對BV2小膠質細胞的活性造成影響，見圖1。

圖1 OGD對HT22細胞以及OGD CM對BV2細胞活力的影響(n=6)

2.2 OGD CM誘導BV2細胞NKG2D受體信號通路表達 qPCR法檢測OGD CM刺激BV2細胞后NKG2D信號通路的表達，相比BV2-Control組，BV2-Model組細胞NKG2D受體、配體H60以及接頭蛋白DAP10 mRNA表達量明顯上調(P<0.01)；而配體MULT1和RAE-1的表達量無明顯變化(P>0.05)，見圖2。

圖2 OGD CM對BV2細胞NKG2D信號通路的影響(n=6)

2.3 OGD CM誘導BV2細胞炎癥因子的生成 qPCR法檢測OGD CM刺激BV2細胞后炎癥因子的表達，相比BV2-Control組，BV2-Model組TNF-α的mRNA表達水平明顯上調(P<0.01)，見圖3。

圖3 OGD CM對BV2細胞炎癥因子表達的影響(n=6)

3 討論

腦卒中是世界范圍內致死/致殘的疾病之一，其中缺血性腦卒中占絕大部分。缺血性腦卒中病理機制復雜，其中神經炎癥在缺血性腦卒中的發生發展過程中發揮重要作用。在缺血性腦卒中初期，腦中常駐的小膠質細胞被激活、外周免疫細胞向缺血腦組織浸潤以及多種細胞因子(IL-6、TNF-α等)產生，從而引發神經炎癥反應[18-20]。研究表明，抑制腦缺血后神經炎癥的發生，不僅能有效減輕腦缺血損傷，還能改善其預后[21]。

本實驗建立小鼠海馬HT22神經元細胞OGD模型，收集HT22上清刺激BV2小膠質細胞，模擬體內腦缺血后小膠質細胞和神經元細胞的相互作用狀態。結果顯示，與HT22-Control組比較，HT22-Model組細胞活性顯著降低，提示OGD造模成功。

NKG2D是一種免疫細胞表面的活性受體，可識別多種配體，研究發現小鼠NKG2D配體包括RAE-1、H60和MULT1[22]。NKG2D與其配體的相互作用是調節先天性免疫反應和適應性免疫反應的關鍵。在小鼠體內NKG2D主要通過PI3K/STAT5和Syk/ZAP70兩條信號通路發揮效應[10,23]。當配體被識別時，含有NKG2D的NK細胞和T細胞被激活，從而導致靶細胞的裂解或是觸發細胞因子和趨化因子(如干擾素-γ)的產生，以調節免疫炎癥反應[24]。有研究報道，NKG2D可在多種器官缺血性損傷炎癥反應中發揮重要作用。Calabrese等[26]發現激活NK細胞表面NKG2D可加重肺缺血再灌注損傷，而阻斷NKG2D受體則可發揮保護作用。Feng等[26]報道，小鼠腎臟缺血再灌注可誘導NKG2D的配體RAE-1表達，從而激活NK細胞和CD8+T細胞、加重腎損傷。本實驗通過建立體外OGD模型探究BV2細胞中NKG2D信號通路的表達，結果表明BV2-Model組細胞NKG2D受體、配體H60、下游接頭蛋白DAP10的mRNA水平顯著增加。腦缺血發生后，炎性細胞因子的表達顯著增加。因此我們檢測了BV2-Model組細胞培養上清中TNF-α的mRNA水平和蛋白水平，結果表明，TNF-α的mRNA水平和蛋白水平顯著上調。

4 結論

氧糖剝奪能促進小膠質細胞H60/NKG2D/DAP10信號通路上調及炎癥因子產生，提示NKG2D信號通路可能在氧糖剝奪的小膠質細胞炎癥反應中發揮重要作用，但具體的機制有待進一步研究。