口腔鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后相關(guān)基因標(biāo)志物的生物信息學(xué)分析

王力業(yè)， 高鶯, ， 田淳

1.山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，山西 太原（030001）； 2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院口腔科，山西 太原（030001）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是常見癌癥類型，約占所有口腔惡性腫瘤的90%［1-2］。在OSCC 治療中的關(guān)鍵是探索新的可靠的分子標(biāo)志物提高癌癥患者的早期診斷，并識(shí)別和定位耐藥機(jī)制。生物信息學(xué)的發(fā)展使基因表達(dá)譜被廣泛應(yīng)用于識(shí)別生物標(biāo)志物。通過訪問不同類型的數(shù)據(jù)庫，包括大規(guī)模的臨床信息、基因測(cè)序和表達(dá)水平，可進(jìn)行各種類型癌癥的標(biāo)準(zhǔn)化分析［3］。篩選腫瘤組織和正常組織中差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）將有助于進(jìn)一步闡明OSCC 的發(fā)病機(jī)制，并可能為早期診斷和治療提供有希望的生物標(biāo)志物或靶點(diǎn)。影響OSCC預(yù)后的中樞基因尚未完全確定，大多數(shù)研究只針對(duì)數(shù)據(jù)庫中的單個(gè)基因，關(guān)于聯(lián)合遺傳模型預(yù)測(cè)預(yù)后的研究較少。因此，本研究嘗試?yán)寐?lián)合遺傳模型尋找OSCC 預(yù)后的關(guān)鍵基因，為在臨床預(yù)測(cè)OSCC 患者預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 研究方法

1.1 數(shù)據(jù)提取及處理

從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心創(chuàng)建并維護(hù)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫中獲取OSCC 相關(guān)的三個(gè)芯片數(shù)據(jù)GSE23558、GSE37991、GSE30784，其中包括73 例OSCC 和50 例癌旁樣本。數(shù)據(jù)集中均使用人類口腔組織樣本，均包括健康組和對(duì)照組。利用GEO 數(shù)據(jù)庫提供的GEO2R 在線工具和維恩在線軟件對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，顯著差異表達(dá)基因的判定標(biāo)準(zhǔn)為|log（差異倍數(shù)）|≥1、P＜0.05，并進(jìn)行可視化。

1.2 基因本體論富集分析和通路分析

為了對(duì)DEGs 進(jìn)行全面的注釋，采用R/bioconductor 的“clusterProfiler”程序包進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（the kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。篩選標(biāo)準(zhǔn)是落在單個(gè)term 上差異基因，按照富集程度的值進(jìn)行排列。

1.3 DEGs 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析及中心基因的鑒定

DEGs 相互作用使用STRING（http：//string-db.org/）在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件并繪制網(wǎng)絡(luò)圖，用MCODE 插件對(duì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的模塊進(jìn)行檢測(cè)，找出蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的集群即高度互連的區(qū)域，找出核心基因。

1.4 總體生存分析并進(jìn)行驗(yàn)證

使用Kaplan Meier-plotter 網(wǎng)站工具評(píng)估核心差異基因在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的總生存率，隨后利用GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/）網(wǎng)站對(duì)與預(yù)后相關(guān)的核心基因進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs 篩選結(jié)果

通過對(duì)三個(gè)數(shù)據(jù)集的分析，共篩選出212 差異性基因，與正常組織相比，OSCC 中包括74 個(gè)上調(diào)和138 個(gè)下調(diào)差異性基因（表1）。

2.2 GO 和KEGG 富集分析

GO 功能注釋顯示DEGs 主要參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞粘附細(xì)胞增殖的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程。DEGs 主要分布于細(xì)胞外來體、胞外區(qū)、蛋白質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)等，參與到鈣離子結(jié)合、肝素結(jié)合、受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性等（圖1）。DEGs 進(jìn)行KEGG 通路分析，結(jié)果顯示主要富集在癌癥通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、精氨酸和脯氨酸代謝、組氨酸 代謝、PPAR 信號(hào)通路（圖2）。

表1 口腔鱗狀細(xì)胞癌的差異表達(dá)基因Table 1 Venn diagrams of differentially expressed genes of OSCC

Figure 1 Gene ontology enrichment analysis results of differentially expressed genes in OSCC圖1 口腔鱗狀細(xì)胞癌的差異表達(dá)基因的基因本體論分析結(jié)果

Figure 2 Differentially expressed genes in OSCC are involved in metabolic pathways圖2 口腔鱗狀細(xì)胞癌的差異表達(dá)基因參與的代謝途徑

2.3 建立蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行模塊分析

使用STRING 在線軟件進(jìn)行分析，得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，將數(shù)據(jù)輸入Cytoscape 軟并獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，隨后使用MCODE 插件進(jìn)行模塊化分析（degree cutoff = 2，node score cutoff =0.2，k-core = 2，max= 100）最終獲得16 個(gè)核心基因（圖3）。

Figure 3 Constructed protein-protein interaction network of differentially expressed genes in OSCC圖3 口腔鱗狀細(xì)胞癌的差異基因蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 核心基因生存分析并驗(yàn)證

利用Kaplan-Meier 在線工具分析差異基因的預(yù)后信息，顯示16 個(gè)核心基因中有6 個(gè)基因高表達(dá)，與不良生存率顯著相關(guān)（P＜0.05），這6 個(gè)基因分別是：極光激酶A（aurora kinase A，AURKA）、極光激酶B（aurora kinase B，AURKB）、細(xì)胞凋亡抑制因子5（baculoviral IAP repeat containing 5，BIRC5）、細(xì)胞分裂周期蛋白6（cell division cycle 6，CDC6）、E2F 轉(zhuǎn)錄因子7（E2F transcription factor 7，E2F7）、泛素樣含PHD 和環(huán)指域蛋白1（ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1，UHRF1）（圖4）。隨后，利用GEPIA 挖掘癌癥組織和正常組織之間6 個(gè)基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與正常組織相比，AURKA、AURKB、BIRC5、CDC6、E2F7、UHRF1 等6 個(gè)核心基因在癌癥組中均表達(dá)較高（P＜0.05）（圖5）。

3 討 論

隨著生物信息學(xué)發(fā)展，人們逐漸加深了對(duì)OSCC 的認(rèn)知，Zheng 等［4］通過生物信息學(xué)分析OSCC腫瘤組織和相鄰正常組織臨床樣本的微陣列，得到與OSCC 相關(guān)的15 個(gè)核心差異基因，并通過定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)一步檢測(cè)OSCC 腫瘤與非腫瘤之間的關(guān)系。Zhang 等［5］通過生物信息學(xué)分析識(shí)別OSCC 中異常甲基化的差異基因，結(jié)果顯示這些基因在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答過程中被富集，主要參與PI3K-AKT 和EMT 通路。本研究整合了來自多個(gè)數(shù)據(jù)集芯片數(shù)據(jù)以識(shí)別OSCC 中生物標(biāo)志物，與單一數(shù)據(jù)集分析進(jìn)行比較結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確可靠。

Figure 4 The prognostic information of the core genes in OSCC圖4 口腔鱗狀細(xì)胞癌核心基因的預(yù)后信息

Figure 5 Validation of the expression levels of critical genes in OSCC圖5 驗(yàn)證口腔鱗狀細(xì)胞癌核心基因表達(dá)水平

本研究使用GEO 數(shù)據(jù)庫下載了三個(gè)基因芯片用于OSCC 的生物信息學(xué)分析與整合最終獲取16個(gè)核心基因，其中與口腔癌患者生存率密切相關(guān)的候選基因有6個(gè)：AURKA、AURKB、BIRC5、CDC6、E2F7、UHRF1。對(duì)以上基因進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，證實(shí)上述基因與OSCC 的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。BIRC5、UHRF1 主要參與細(xì)胞凋亡的抑制。BIRC5被認(rèn)為是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子［6］。BIRC5 編碼的蛋白Survivin 可以直接抑制末端效應(yīng)酶caspase-3 和caspase-7 的活性，抵抗特定刺激引起的細(xì)胞凋亡，還可以與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK-4 和CDK-2 相互作用抑制凋亡信號(hào)通路［7］。Troiano 等［8］對(duì)OSCC 和正常口腔黏膜進(jìn)行生物信息學(xué)和組織學(xué)的綜合分析，發(fā)現(xiàn)Survivin 蛋白在腫瘤組織中呈高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞較高的增殖率以及較差的預(yù)后密切相關(guān)。UHRF1 是泛素樣含PHD 和環(huán)指域蛋白家族的主要成員之一，能夠調(diào)節(jié)DNA 甲基化和組蛋白修飾之間的相互連接，是重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控因子。Polepalli 等［9］研究認(rèn)為UHRF1 通過抑癌基因啟動(dòng)子高甲基化，沉默抑癌基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制其凋亡，參與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。UHRF1 基因的敲除可降低壞死受體相互作用激酶-3 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子啟動(dòng)子的甲基化水平，導(dǎo)致壞死受體相互作用激酶-3 表達(dá)增加，從而導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)下降，其潛在的分子機(jī)制有助于開發(fā)腫瘤治療藥物［10］。Baroudi 等［11］發(fā)現(xiàn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中UHRF1 的過表達(dá)與腫瘤侵襲性相關(guān)，不僅有助于評(píng)估患者預(yù)后，還具有對(duì)患者進(jìn)行臨床分期的診斷價(jià)值。

AURKA、AURKB、CDC6、E2F7 與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)。Guo 等［12］采用RNA 干擾技術(shù)靶向抑制E2F7 在腫瘤中的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用，該實(shí)驗(yàn)同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在TF-target 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，E2F7 可以調(diào)控CDC6 基因表達(dá)。E2F7 過表達(dá)不僅與癌癥預(yù)后相關(guān)，還會(huì)引起頭頸部鱗狀細(xì)胞癌治療中蒽環(huán)類藥物的耐藥性。Hazar-Rethinam 等［13］證明E2F7定位錯(cuò)誤引起RacGAPI 和Sphk1/S1P 表達(dá)下調(diào)，該網(wǎng)絡(luò)與耐藥性直接相關(guān)，并且觀察到E2F7 可能是通過AURKB 作用于RacGAPI 從而激發(fā)耐藥。Saen-Ponce 等［14］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，E2F7 從細(xì)胞核輸出后錯(cuò)誤定位于細(xì)胞質(zhì)中是通過病理激活XPO1 途徑所致，并且在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌異種移植模型中使用XPO1 抑制劑實(shí)現(xiàn)了對(duì)蒽環(huán)類藥物耐藥性的逆轉(zhuǎn)，逆轉(zhuǎn)E2F7 核輸出可能為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的治療及提高生存率提供機(jī)會(huì)。CDC6 是DNA 復(fù)制必不可少的蛋白，其與其他調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合形成“復(fù)制前復(fù)合體”，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，同樣可以促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化［15］。Feng 等［16］使用RTPCR 及免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CDC6 的mRNA 和蛋白在正常口腔黏膜中低表達(dá)，在癌前病變和OSCC 中呈高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)OSCC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中CDC6表達(dá)明顯高于非轉(zhuǎn)移性癌，為了進(jìn)一步證實(shí)與舌鱗癌細(xì)胞的關(guān)系，該研究者敲除CDC6 的基因后發(fā)現(xiàn)舌鱗癌Tca8113 細(xì)胞的增殖、遷移受到了明顯的抑制［17］。AURKA、AURKB 均屬于有絲分裂絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，AURKA 參與維持細(xì)胞中心粒和染色體的精確分離過程，AURKB 主要參與細(xì)胞從G2期到M 期的分裂，二者的過度表達(dá)均與腫瘤不良預(yù)后相關(guān)。Huang 等［18］發(fā)現(xiàn)AURKA 基因多態(tài)性表達(dá)水平和吸煙聯(lián)合檢測(cè)可以作為OSCC 診斷和預(yù)后的重要分子標(biāo)志物，吸煙伴AURKA 基因高表達(dá)者患口腔癌風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，對(duì)篩選口腔癌高危人群有一定參考價(jià)值。Yang 等［19］證明AURKA的抑制劑MLN8237 一方面可以通過抑制AURKA在Thr288 的自磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞不能正常分裂，另一方面誘導(dǎo)細(xì)胞周期在G2/M 期停止細(xì)胞出現(xiàn)衰老，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。已有學(xué)者觀察到在頭頸部腫瘤中AURKB 的高表達(dá)與細(xì)胞增殖和淋 巴 結(jié) 轉(zhuǎn) 移 相 關(guān)［20］。Bertran-Alamillo 等［21］使 用AURKB 抑制劑處理可降低pH3 水平，從而觸發(fā)G1/S 阻滯和多倍體化，在生長(zhǎng)停滯和多倍體化之后，抑制AURKB 會(huì)引發(fā)不同類型腫瘤細(xì)胞的衰老或死亡。Togar 等［22］對(duì)OSCC 細(xì)胞的基因進(jìn)行了篩選并評(píng)級(jí)，最后識(shí)別出AURKB 對(duì)OSCC 細(xì)胞增殖至關(guān)重要，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中對(duì)AURKB 進(jìn)行藥理抑制發(fā)現(xiàn)抑制癌癥細(xì)胞增殖。Boeckx 等［23］比較西妥昔單抗敏感細(xì)胞和耐藥頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系的全基因組mRNA 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的AURKB 通過RAS-MARK 信號(hào)通路作用導(dǎo)致耐藥性的發(fā)生，因此使用AURKB 抑制劑阻斷該通路可能是在治療中克服西妥昔單抗耐藥性的新策略。AURKA、AURKB是癌癥治療中另一重要靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)工具分析了OSCC 組織和相鄰正常組織的基因表達(dá)差異，找出與腫瘤相關(guān)的核心基因，并對(duì)這些關(guān)鍵基因參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行挖掘。但一些基因在OSCC 中的功能及其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究，同樣需要用大量獨(dú)立樣本集對(duì)這些標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證。