自噬的檢測方法及其在相關疾病中的研究進展*

竇婷婷，金 玲，池宇欣，趙云利

(蚌埠醫學院公共衛生學院，安徽 蚌埠 233000)

自噬是真核細胞特有的“自食”現象，也是細胞進行自我保護的代謝途徑[1]，在多細胞生物遇到危險時可進行應激與防御調控。自噬發生時，胞內需降解的細胞器、蛋白質和部分胞質被膜包裹形成自噬體，而后與溶酶體等結合形成自噬溶酶體并對包裹內容物進行降解與回收，實現物質與細胞器的更新，維持胞內物質與能量供給的平衡[2]。自噬在維持細胞內穩態方面發揮著重要功能：在正常生理條件下，細胞通過較低水平的自噬持續維持細胞內穩態；而在細胞遇到能量供應短缺、缺氧、雷帕霉素等因素的刺激時，啟動自噬可以使細胞緩解代謝壓力，維持內環境穩定[3]。適度的自噬對維持細胞物質與能量的平衡是有益的，但過度的自我消化則會對細胞產生傷害，因此，自噬的調節有助于維持細胞的正常生理功能。為進一步加深對自噬及其檢測方法的認識，本文從自噬的基本過程、自噬的檢測方法及自噬的生物學功能等幾個方面對自噬進行綜述。

1 自噬的基本過程

根據自噬發生時底物進入溶酶體的途徑和特點，可以將自噬分為巨自噬、微自噬以及分子伴侶介導的自噬三種類型。其中巨自噬的特征最明顯，研究的也最為廣泛與深入。

巨自噬是細胞質中的自噬底物被含有雙層膜結構的自噬體包裹隔離，進而將自噬底物運送至溶酶體進行降解的過程。巨自噬是一個動態的過程，包括底物的識別、自噬體的形成、自噬體與溶酶體的融合以及自噬溶酶體的降解四個不同的步驟[4],見圖1。

圖1 巨自噬的基本過程[4]

1.1底物的識別 自噬的底物可以是衰老損傷的細胞器和折疊合成錯誤的蛋白質，也可以是外來侵入細胞的細菌和病毒。化學刺激或細胞成分的損傷與改變，如化學污染物、受損的線粒體和錯誤折疊的蛋白質等，都可被受體蛋白識別成為自噬底物。

1.2自噬體的形成 自噬體初始形成需要Ⅲ類磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)復合物來刺激吞噬膜的形成，且PI3K復合物能夠與自噬相關蛋白(autophagy-related,Atg)聯合將兩個相關聯的泛素樣結合系統Atg12-Atg5-Atg16和Atg8-PE(磷脂酰乙醇胺，phosphatidyl ethanolamine，PE)結合到吞噬泡中，促使吞噬泡膜進一步延伸、彎曲至吞噬泡能夠將自噬底物完全包裹并形成球狀的自噬小體[5]。

1.3自噬體與溶酶體的融合 自噬體形成后，在微管蛋白的作用下，逐漸向溶酶體靠近，接著自噬體中的外層膜與溶酶體膜相融合，形成自噬溶酶體。其中，有些自噬體會先與核內體結合形成自噬內涵體[6]，然后再與溶酶體結合。這一融合過程依賴于溶酶體膜蛋白(Lysosomal-associated membrane protein 2,LAMP-2)和N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SolubleN-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor,SNARE)蛋白等多種因子的聯合作用[7]。

1.4自噬溶酶體的降解 大部分的Atg蛋白會與融合體分離，自噬溶酶體及自噬內涵體內的膜結構及所包裹的底物在溶酶體腔的酸性環境下經蛋白酶A、B及脂肪酶Atg15等作用降解釋放進入再循環系統[8]。

2 自噬的檢測方法

2.1形態學檢測—透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)檢測 透射電鏡下觀察吞噬泡是目前最為直接和經典的自噬檢測方法，通過TEM可以觀察處于不同階段的自噬體以及計數其數量從而判斷自噬的發生水平[9]。在透射電鏡下可以觀察到新月狀或杯狀的吞噬泡、具有雙層或多層膜包裹的液泡狀自噬小體，但具體觀察受實驗者對于鏡下自噬體結構的準確判斷、觀察樣品的制備過程等的影響，因此會存在一些主觀上的偏差，通常與其他檢測方法結合使用。

2.2自噬相關蛋白-微管相關蛋白輕鏈3表達水平的檢測 微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain，LC3)是自噬體雙層膜上的標志性蛋白[10]，其中水溶性的LC3-Ⅰ在經過泛素化作用后能與PE結合轉化為脂溶性的LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ特異性定位于自噬體內膜和自噬溶酶體膜上，在自噬體與溶酶體結合后LC3-Ⅱ才逐漸分離降解。因此，可使用LC3-Ⅱ的表達量或者LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值來檢測自噬水平。

2.2.1綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)-LC3單熒光質粒檢測法 正常生理狀態下，GFP-LC3結合蛋白分布于細胞質中，自噬發生時，GFP-LC3結合蛋白移位到自噬體內膜上表達出綠色熒光斑點[11]，一個自噬體就表現為一個斑點，因而通過GFP-LC3單熒光質粒計數就可以評估自噬程度的高低。

2.2.2紅色熒光蛋白(red fluorescent protein,RFP)-GFP-LC3串聯熒光蛋白標簽法 由于GFP熒光蛋白對酸敏感，在自噬小體與溶酶體結合后GFP熒光會淬滅從而給檢測帶來難度[12]，而RFP相對穩定，因此可以采用RFP-GFP-LC3串聯熒光蛋白檢測自噬，即帶有雙標熒光信號的RFP-GFP-LC3-Ⅱ串聯蛋白成功在細胞表達時，通過觀察不同顏色的熒光信號強度的變化就可以判斷出該細胞的自噬水平。

2.2.3GFP-LC3-RFP-LC3△G檢測法 在Atg4的作用下，GFP-LC3-RFP-LC3△G串聯熒光標簽蛋白可被分割成GFP-LC3和RFP-LC3△G兩個部分。其中GFP-LC3可在自噬過程中降解，而RFP-LC3△G不能與PE結合，故不作為自噬的降解底物[13]。因此，可通過測量GFP/RFP信號的比值可以反映自噬活性，這一方法在酵母的自噬檢測中應用較多。

2.2.4Western blot檢測法 Western blot檢測LC3-Ⅱ蛋白表達水平是目前最為廣泛的檢測自噬流的方法。通常認為在Western blot實驗中檢測到LC3-Ⅱ的增多是LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化增多，代表了自噬流的活化；LC3-Ⅱ減少則代表自噬受到抑制[14]。

2.3自噬降解底物檢測

2.3.1p62結合LC3-Ⅱ蛋白翻轉實驗法 p62是選擇性自噬最重要的受體蛋白，能夠連接待降解的泛素化底物與LC3-Ⅱ蛋白[15]。p62結合泛素化底物蛋白進入自噬小體，并與溶酶體結合形成自噬溶酶體，而后在溶酶體腔內的酸性水解酶作用下降解。當自噬流活化時，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化，LC3-Ⅱ增多，p62水平下降，但自噬流受到抑制時p62含量上升，因此監測p62蛋白的水平就可以反映出自噬水平。

2.3.2長壽命蛋白(longevity protein Sir2)檢測法 長壽命蛋白是可以被自噬降解的一類蛋白。真核細胞生物既可以通過蛋白酶體系統對短壽命蛋白進行降解，也可通過自噬對長壽命蛋白和受損細胞器進行降解。對長壽蛋白進行同位素標記，通過自噬降解蛋白產物的三氯乙酸-放射性同位素定量，進而反映自噬水平[16]。

2.4自噬誘導劑的應用

2.4.1雷帕霉素 哺乳動物雷帕霉素靶點(mammalian target of rapamycin，mTOR)是自噬的重要調控因子，可通過抑制自噬復合物ULK-ATG13-FIP200形成，從而抑制自噬過程的激活[17]。mTOR與不同蛋白結合可形成mTORC1及mTORC2兩種復合物。另外，雷帕霉素還可以劑量依賴的方式激活Beclin-1基因表達，來增加自噬泡的形成。

2.4.23-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA) 研究證明3-MA選擇性的作用于3型PI3K，主要是通過抑制Beclin-1-Ptdlns 3KC3復合物的形成來抑制細胞質內可溶性LC3-Ⅰ向可以與自噬體膜結合的LC3-Ⅱ形式轉化，從而抑制自噬體的形成來完成對自噬的阻斷[18]。

2.4.3二甲雙胍 二甲雙胍可通過不同的作用機制影響自噬的進展，主要作用與抑制mTORC1有關。mTORC1參與腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated kinase,AMPK)的活化，AMPK通過激活Vps34復合物并磷酸化Beclin-1來誘導自噬[19]。當細胞能量水平受限時，AMPK可直接磷酸化酵母ATG1的同源物(unc-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1)，再磷酸化Beclin-1抑制mTORC1復合物來促進自噬。

3 自噬在相關疾病中的研究進展

細胞自噬的功能主要有兩個方面：一是細胞的自我存活機制，當細胞處于脅迫狀態下時，可通過自噬將胞質中部分底物進行降解形成小分子物質如氨基酸，核苷酸等，為細胞的存活和發展提供物質基礎；另一方面，自噬可以清除細胞內折疊錯誤或變性的蛋白質，衰老損傷的細胞器等，維持細胞內穩態[20]。

3.1細胞自噬與腫瘤的發生

3.1.1自噬與腫瘤的發生 自噬在腫瘤的發生中起到了促進和抑制的雙重作用。在腫瘤細胞生長前期，自噬通過降解腫瘤細胞內的受損細胞器或其他物質，可為腫瘤細胞的持續分裂增殖提供大量的營養物質，減少腫瘤細胞的凋亡和壞死而使其持續存在。研究表明，經c-myc誘導的鼠淋巴瘤中，使用自噬抑制劑(如氯喹)抑制細胞自噬活性時，由p53或DNA烷化劑誘導的腫瘤細胞死亡的有效性將增強，繼而使腫瘤細胞消亡[21]。另一方面自噬可以抑制細胞癌變，如Fu等[22]發現持續的應激或自噬過度活化時，Beclin-1蛋白通過增強細胞自噬活性來抑制腫瘤的發生：Beclin-1基因敲除的小鼠，自噬活性降低，發生肺癌/肝癌或淋巴瘤的概率增加。依維莫司是一種雷帕霉素類似物，它可以通過阻止mTORC1的磷酸化來抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路。

3.1.2自噬與腫瘤的發展 自噬既能抑制早期腫瘤的發生又能促進腫瘤的發展，其功能的發揮不僅取決于遺傳因素，還與腫瘤的發展階段以及腫瘤的類型等因素有關。正常情況下，自噬會對代謝應激損傷以及基因組的異常突變等起到一定的限制作用，從而抑制腫瘤的發生。研究表明，自噬相關ATG蛋白(如Beclin1)功能的喪失會增加腫瘤的發生風險[23]。自噬作用的轉變發生在原發性腫瘤形成后：自噬在應對各種不良應激時會為腫瘤細胞提供存活和快速增殖提供物質和能量支持，從而促進部分腫瘤的晚期增長。Liang等[24]發現，在乳腺癌的上皮組織中Beclin1呈現低表達，而在正常細胞中表達明顯升高；人乳腺癌MCF-7細胞株在穩定轉染Beclin1后，其成瘤性明顯降低，并且提高了腫瘤細胞的自噬程度。在癌細胞系中敲低或者刪除必需自噬基因的表達可以降低其存活率和腫瘤發生，從而確立自噬在促進腫瘤發生發展的功能重要性。

3.2細胞自噬與神經退行性疾病 研究表明，自噬異常與神經退行性疾病之間密切相關。大多數神經退行性疾病是以進行性神經系統功能障礙為特征，主要是由于神經細胞內發生了蛋白的錯誤折疊或聚集而導致神經元進行性地損傷/變性和死亡，繼而影響機體運動功能的異常及學習功能的障礙。神經退行性疾病的產生常伴有細胞自噬水平的下降，而激活的自噬可以通過清除神經元細胞中的異常蛋白從而阻礙與減緩神經退行性疾病的發生[25]。但過度激活的自噬通路又會導致胞內聚集大量的自噬體和自噬溶酶體，使神經元發生退化、變性甚至死亡。這類疾病主要包括帕金森病和阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)。

淀粉樣蛋白-β(amyloid-β,Aβ)是由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)經過β、γ分泌酶兩次剪切而形成[26]，其所致的神經炎性斑是AD的主要病理學改變。一些研究表明上調自噬作用會降低Aβ的表達水平，但在自噬體中也可以產生Aβ。研究表明AD神經元中堆積的自噬小體中含有早老蛋白-1(Presenilin-1,PS1)和APP，而其中的PS1是APP剪切形成Aβ所需的γ-分泌酶復合物的組成成分。敲除APP轉基因小鼠中的ATG7基因，出現Aβ分泌的減少，這一現象與自噬僅僅降解了Aβ相違背[27]。因此，自噬在AD中的作用一直存在爭議，這可能是因為自噬在疾病的不同階段有著不同的作用，或者與自噬對淀粉樣蛋白生命周期不同步驟的影響有關。

3.3細胞自噬與免疫應答 自噬可維持細胞內穩定，還可以保護細胞免受外來病原體的入侵。自噬最初被認為是一種原始防御系統，可抵御入侵的微生物，同時也在多種先天和適應性免疫途徑中發揮作用。自噬可以結合入侵到細胞內的細菌和病毒形成自噬小體或者自噬內涵體，并將其轉送至溶酶體進行降解。此外，自噬還可以將外來病原體的核酸轉運至胞內相關感受器上引發機體自身的免疫反應。涉及自噬的主要免疫功能包括微生物降解/炎癥控制/淋巴細胞穩態和免疫介質的分泌。自噬在先天免疫中可通過抑制炎癥體的激活來抑制炎癥，通過清除蛋白質聚集體、降解異常的線粒體和直接消除炎癥體成分[28]。

3.3.1對病原體的反應 GROL[29]等的研究表明自噬可清除病原體，自噬能夠定向的將待降解的病原體運送到溶酶體，如經CD400刺激作用可使自噬蛋白Beclin1的表達量增加，并且能夠增強LC3的脂化作用。另一方面，有研究表明，病原體也會逃避自噬：小鼠在感染結核分枝桿菌后，自噬體中強毒株菌株可通過晚期核內標志物RAB7進行補充，形成中間區的兩親體，而沒有被結核桿菌感染的細胞中的自噬體將會繼續成熟為自溶體。此外，病原體還可以利用自噬來增強自身復制：無包膜的病毒產生自噬時，通過激活AMPK依賴型信號傳導，干擾自噬膜的運輸途徑，可轉運到病毒復制位點。

3.3.2免疫應答過程中的自噬調控 固有免疫與自噬研究表明，自噬可參與TLR、NLR、RLR信號通路等先天性免疫應答。RIG-1樣受體(RLRs)可識別胞質中的病毒dsRNA，通過NF-κB途徑，誘導產生大量干擾素及炎性細胞因子。Atg5和Atg12復合體可與RLR結合，從而抑制經該通路活化抗病毒時干擾素的產生[30]；當復合物所必需的Atg7缺失時也會促進通路中干擾素的表達。適應性免疫與自噬,細胞自噬相關蛋白在與B細胞和T細胞的許多生理功能方面發揮重要作用。部分自噬相關蛋白，如Beclin1和Atg3，對T細胞的存活、發展及穩態起到重要作用。自噬能夠維持內質網及線粒體的穩態，并能控制ROS的含量及功能，這都會直接影響T細胞的生存[31]。T細胞的活化選擇性的誘導自噬降解細胞中折疊錯誤的蛋白質及功能紊亂的細胞器等，為T細胞的活化提供了能量基礎。研究表明，Atg7敲除的Th細胞，經活化后不再分泌IL-2且增值能力大幅降低，這可能與自噬缺陷所導致的能量代謝缺陷有關。

3.4細胞自噬與細胞的分化和衰老 利用酵母菌/線蟲和小鼠等進行的遺傳研究表明，在限制熱量/胰島功能喪失和其他保守的長壽模式中，ATG基因是延長壽命所必需的[32]。系統性自噬誘導對小鼠具有抗衰老作用，自噬能力增強的基因工程小鼠壽命延長且改善了健康狀況，例如胰島素敏感性增加以及與年齡相關的自發性腫瘤發生率的降低。自噬可以通過改善細胞器質量控制體內平衡/增強胰島素敏感性和促進基因組穩定性來防止衰老。ATG基因可能具有促進壽命的自噬獨立效應，例如，它們在分泌和胞吐中的作用可能有助于組織間效應。

在線蟲/小鼠和哺乳動物的一系列組織中，自噬基因表達和溶酶體功能會隨著年齡的增長而下降，導致自噬能力的年齡相關性下降[33]。這種與年齡相關的衰退可能有助于老年相關疾病的發展，如神經退行性疾病和癌癥。自噬作用會隨著細胞的老化而減弱，同時，下降的自噬也會進一步加速細胞的衰老。在秀麗線蟲的研究中發現，自噬相關基因Atg1和Atg6/Beclin1沉默的秀麗線蟲壽命顯著縮短，表明自噬的降低會促進衰老的進程。

3.5自噬與環境應激 有實驗研究表明，一些環境化學物質，如重金屬和顆粒物等，會對自噬過程起干擾作用[34]。細胞自噬在某些情況下能幫助細胞抵抗不良的環境應激，但不同的環境化學物質對自噬途徑產生不同的影響，可能取決于其暴露的劑量、時間及作用的細胞類型等。如機體受到毒金屬鎘的刺激時，參與細胞能量生成途徑的蛋白質會遭到破壞并引發活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成，而ROS的增加和mTOR系統的抑制會激活自噬。此外，鎘暴露還可降低Atg5和LC3的表達，長期暴露還可干擾自噬體的融合[35]。

4 展望

自噬作用的意義是多方面的，它與細胞凋亡、細胞壞死一樣，都是十分重要的生物學現象，參與細胞生物的生長、發育等多個過程，與人類多種疾病的發生發展存在著密切的關系。深入對自噬相關過程及機制的研究不僅會使我們對自噬這一現象有更深的認識，也將會為我們認識自噬相關疾病的發生發展提供依據。