石榴籽油對骨性關節炎大鼠膝關節病理形態及相關細胞因子mRNA水平的影響研究*

劉雄偉，張 濤，邵 國，馬志朋，王睿甲，許文勝

(1.內蒙古科技大學包頭醫學院，內蒙古 包頭 014010；2.內蒙古科技大學包頭醫學院第三附屬醫院；3.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院關節一科)

骨性關節炎(osteoarthritis，OA)是一種表現為關節疼痛和退行性病變的疾病，主要特征為軟骨退變、周圍骨重塑和多種關節組織發生病理變化[1]。關節軟骨是一種薄的結締組織，覆蓋于關節中長骨的承重表層，其獨特的基質組成在關節運動中提供了幾乎光滑的表面。軟骨細胞是軟骨中單一存在的細胞，利用基質的合成和分解來維持軟骨基質的穩態均衡。OA的病因和發病機制復雜，通常與年齡、炎癥、創傷、代謝紊亂、肥胖、遺傳等因素有關，目前比較一致的觀點是本病與滑膜炎性反應及軟骨代謝水平異常密切相關[2]。

石榴籽油(pomegranate seed oil，PSO)是植物來源的Omega-3多不飽和脂肪酸(n-3Polyunsaturated fatty acid，n-3PUFAs)，其主要成分為石榴酸，約占86.0 %以上，其化學組成是十八碳三烯酸(C18：3n-5，cis-9，trans-11，cis-13)，化學結構式如圖1所示。因PSO具有抗氧化、清除自由基、抗衰老和類雌激素等多種藥理學功效[3]，推測PSO在OA炎癥過程中會起到一定影響作用。

圖1 石榴酸化學結構式

OA的病理改變過程中，存在于關節軟骨細胞中的一些細胞因子、基質金屬蛋白酶起著比較重要的影響作用，比如，MMP-1、CoⅡ都是非常重要的影響因子。因此，針對以上細胞因子設計了如下實驗：通過RT-PCR從mRNA水平對以上目的基因進行檢測分析，通過不同干預劑量探究石榴籽油對骨性關節炎病理變化的作用機制。

1 對象與方法

1.1實驗動物 8周齡健康雌性SD大鼠100只，購自內蒙古科技大學包頭醫學院動物實驗中心，許可證號碼SCXK(蘇)：2016-0010。將實驗動物分成5個組，假手術組(Control)、模型對照組(簡稱模型組，Model)、實驗1、2、3組(Experiment1、2、3)。每組各20只。

1.2研究方法

1.2.1手術OA建模 除假手術組實施假手術外，其余4個組均通過改良Hulth法建立OA動物模型，即在經典Hulth法基礎上剪斷前后交叉韌帶和內側副韌帶，切除內側半月板，滴入少量青霉素溶液，縫合關節囊和皮膚。驅趕4周后確認建模成功的情況下，挑選符合條件的動物進入實驗組，實驗組分為低劑量組(實驗1組)、中劑量組(實驗2組)和高劑量組(實驗3組)，每組20只。按照魏偉等[4]編著的《藥理實用方法學》第4版中紹的方法，等效劑量人鼠換算系數為6.3，得出中劑量參考標準為1.27 g/kg，劑量遞增標準0.32 g/kg，從而確定了PSO的灌胃劑量標準。全部5個組動物除喂食普通飼料外，給予假手術組和模型對照組動物1.5 g/(kg·d)生理鹽水灌胃，實驗組3組動物分別給予0.95 g/kg、1.27 g/kg和1.59 g/kg純石榴籽油灌胃，各組大鼠均在相同條件下喂養，自由飲水和進食，每7 d稱重一次，以調整PSO灌胃劑量。繼續喂養12周，麻醉致死后再稱重一次，剪開膝關節至股骨處皮膚，再剪斷交叉韌帶暴露出髁軟骨，將軟組織去除后，切取股骨遠端臨近膝關節部分用10.0 %中性甲醛溶液固定后備檢。

1.2.2檢測方式 (1)Micro CT檢測分析膝關節BV/TV(%)、SMI骨結構參數；(2)RT-PCR檢測軟骨細胞CoⅡ、MMP-1 mRNA表達。

2 結果

2.15個組動物膝關節Micro CT檢測以及骨參數數據分析 (1)大鼠膝關節Micro CT檢測。與假手術組相比，模型對照組與3個實驗組中，大鼠膝關節軟骨下骨的骨小梁發生了不同程度的數目減少，密度降低，存在明顯骨量丟失，有骨質疏松發生。見圖2。(2)大鼠膝關節骨體積分數[BV/TV(%)]。體積分數指所選區域內骨小梁總體積與樣本總體積之比。與假手術組比較，模型組和實驗1、2、3組均減小(P<0.05)；與模型組比較，實驗1、2、3組增加(P<0.05)；實驗1、2、3組數值組間兩兩比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。(3)結構模型指數(SMI)。SMI反映骨小梁板狀結構或棒狀結構特征，理想板狀結構的數值為0，理想棒狀結構的數值為3，骨質疏松發生時，骨小梁從板狀結構轉變向棒狀結構，SMI數值變大。與假手術組比較，模型組和實驗1、2、3組均增加(P<0.05)；與模型組比較，實驗1、2、3組減小(P<0.05)；實驗1、2、3組數值組間兩兩比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

圖2 5個組動物膝關節Micro CT圖

表1 5組動物膝關節Micro CT關節骨參數數據

2.25組動物膝關節軟骨細胞目的基因mRNA表達 采用RT-PCR法，以GAPDH為內參，對MMP-1、CoⅡ因子mRNA進行檢測。引物序列如下，見表2。

表2 目的基因和GAPDH引物序列

(1)MMP-1 mRNA表達結果(圖3)：與假手術組比較模型對照組表達量增加(P<0.01)；實驗1、2、3組與模型對照組比較，表達量減少(P<0.01)；實驗1、2、3組表達量兩兩比較差異無統計學意義(P>0.05)。(2)CoⅡ mRNA表達結果(圖4)：與假手術組比較模型對照組表達量降低(P<0.01)；與模型對照組比較，實驗1、2、3組相對表達量增加(P<0.01)；實驗1、2、3組表達量兩兩比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

圖3 MMP-1 mRNA表達結果

圖4 CoⅡmRNA表達結果

3 討論

微計算機斷層掃描技術(Micro CT)是近年來運用到實驗動物中的新型研究方式，是一種無損傷性的三維(3D)成像技術，可以在實驗材料完整的狀態下清楚認識樣本內部的顯微結構[5]，極大提高了實驗的可靠性。本次實驗結果顯示，與假手術組比較，模型對照組BV/TV(%)減小、SMI增加。與模型組比較，實驗1、2、3組BV/TV(%)增加，SMI減小，說明手術建模后大鼠膝關節骨質發生了OA病理改變，骨小梁總體積減小，骨小梁從板狀結構轉變向棒狀結構加快，骨量流失，骨質疏松發生，而PSO可以改善此病理變化。

在生理條件下，軟骨基質中膠原的合成和降解維持著動態平衡[6]。在骨性關節炎軟骨中，軟骨基質的變性和溶解速率大于合成速率，能直接降解CoⅡ的MMP-1數量增加，使CoⅡ的數量減少,導致軟骨退變[7]。本次實驗RT-PCR結果顯示：與假手術組比較，模型對照組MMP-1 mRNA相對表達量增加，CoⅡ mRNA表達量減小，與模型組比較，實驗1、2、3組MMP-1 mRNA相對表達量減小，CoⅡ mRNA表達量增加，表明術后關節軟骨細胞基質平衡被打破，基質溶解速度加快，軟骨發生退變，而PSO可以有效抑制CoⅡ降解，促進軟骨基質代謝平衡，使關節軟骨彈性恢復起到保護軟骨作用。

從實驗結果分析看出，PSO從低到高劑量改善軟骨細胞MMP-1、CoⅡ mRNA表達量與干預劑量呈非正相關，這可能與在一定濃度范圍內當有效劑量達到峰值后，繼續增加干預量并不能進一步影響相關細胞因子mRNA表達有關。

綜上所述，PSO具有改善OA大鼠膝關節軟骨退變及保護關節軟骨作用的機制可能為：(1)通過上調BV/TV(%)恢復骨體積，降低SMI抑制骨小梁從板狀結構轉變向棒狀結構；(2)通過下調關節軟骨細胞MMP-1 mRNA表達量，抑制軟骨基質降解酶的活性，減緩關節軟骨基質分解；(3)通過上調膠原蛋白CoⅡ的mRNA表達量，促進軟骨恢復彈性，改善軟骨退變。