胃癌組織中Notch1與BPHL基因融合產物的表達及意義*

鄭家雷，莫緩緩，方 向，胡 婷，周陽陽，蘇 方

(1.蚌埠醫學院第一附屬醫院腫瘤內科,安徽 蚌埠 233003;2.中國科技大學附屬第一醫院老年消化科)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，發病率居全球腫瘤第四位，死亡率位居第三位[1]。我國胃癌發病率和死亡率在所有惡性腫瘤中均高居第二位[2]。隨著手術、化療、放療、靶向及免疫治療的綜合治療理念的普及和推廣，一定程度上延長了患者的生存期和提高了生活質量，但根本上未改變胃癌高死亡率[1]。現階段胃癌的治療已經進入精準治療階段，如針對HER-2基因。胃癌HER-2基因的檢測已經作為晚期胃癌臨床治療方案選擇的依據。Notch異二聚體是高度保守的跨膜蛋白質，參與許多細胞進程包括干細胞維持、凋亡、增殖和分化等[3]。1991年Ellisen LW首次從人急性T淋巴細胞白血病中鑒定出來Notch1，提示Notch信號通路可能與腫瘤相關[4]。Yao等研究顯示胃癌發生、發展的過程中Notch信號通路發揮著重要作用[5]。我們在臨床工作中，通過對胃癌疑難病例的研究，在1例患者胃癌組織中檢測到Notch1基因第34外顯子斷裂與BPHL基因第4內含子發生融合，豐度約為2.0 %，促使我們探索Notch1-BPHL融合基因在胃癌中表達水平及其基因突變的意義。

1 對象與方法

1.1對象 選取2018年5月至10月我院腫瘤外科50例初治、手術治療且術后病理證實為胃癌患者的術后石蠟標本為研究對象。其中男性35例,占70.0 %，年齡23～72歲，中位年齡50歲；女15例,占30.0 %，年齡30～75歲，中位年齡52歲。病變局限于黏膜及肌層19例(占38.0 %)，病變侵及漿膜層及臨近組織31例(占62.0 %)。淋巴結陽性轉移22例(占44.0 %)，淋巴結無轉移28例(56.0 %)。高、中分化程度20例(40.0 %)，低、未分化30例(占60.0 %)。納入標準：(1)年齡18～75歲。(2)蚌埠及周邊地區常住人口。(3)既往無胃相關手術史。(4)術前未行靶向、化療及放療史。(5)臨床及病理資料完整。(6)無自身免疫系統疾病和其他系統重大疾病。排除標準：(1)病理為賁門-食管結合部腫瘤。(2)合并其他惡性腫瘤。(3)臨床或病理資料不完整者。

1.2方法 (1)Notch1-BPHL融合基因引物的設計：以Notch1和BPHL基因的cDNA全序列為依據,考慮到采用PCR拼接兩個基因片段及最終試驗目的,確定選擇用于拼接的cDNA片段Notch1基因第1-34外顯子部分與BPHL基因第5-7外顯子部分。Oligo 6.0分析軟件進行引物設計,Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物，引物在NCBI網站進行BLAST比對。最終確定堿基順序：5'-3' GATGACCTGGGCAAGTCCG，3'-5'CAGCAGCATATGTCATTGTAGGAAGTCTTCTGC。(2)Trizol試劑提取標本組織中總RNA(3)瓊脂糖凝膠電泳檢查評價總RNA的完整性。(4)RT-PCR技術擴增目的基因。(5)凝膠電泳鑒定、紫外線燈下切膠。(6)DNA膠回收目的基因，ARMS基因檢測法測序。

1.3統計學分析 應用SPSS 17.0統計軟件進行分析。計數資料用[n(%)]表示，應用χ2檢驗比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1Notch1與BPHL基因融合產物與胃癌臨床病理關系 6例胃癌組織中檢測到Notch1與BPHL基因融合產物，陽性率12.0 %，癌旁組織和正常胃黏膜未檢測到融合基因產物；性別間Notch1與BPHL基因融合產物檢出陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)；是否淋巴結轉移組間Notch1與BPHL基因融合產物檢測陽性率比較差異有統計學意義(P<0.05)；不同分化程度組間Notch1與BPHL基因融合產物檢測陽性率比較差異有統計學意義(P<0.05)；不同浸潤深度組間Notch1與BPHL基因融合產物檢測陽性率比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。Notch1與BPHL基因融合產物在正常黏膜、胃癌組織、轉移淋巴結檢測結果見圖1、圖2、圖3。

圖1 正常胃黏膜無Notch1與BPHL基因融合產物

圖2 胃癌組織Notch1與BPHL基因融合產物

圖3 轉移的淋巴結組織中Notch1與BPHL基因融合產物

表1 Notch1與BPHL基因融合產物與胃癌臨床病理關系

3 討論

自1991年Ellisen LW等首次從人急性T淋巴細胞白血病中鑒定出來Notch1，通過t(7;9)(q34;q3403)使9號染色體的Notch1基因斷裂，Notch1胞外區丟失，從而胞內區獲得活性而表現出致癌作用，提示Notch信號通路可能與急性T淋巴細胞白血病相關[4]。隨后研究表明，Notch通路對結直腸癌、乳腺癌等具有促進腫瘤進展的作用，而對于甲狀腺癌、非小細胞肺癌等部分腫瘤起到抑癌作用[6]。更有研究結果顯示，Notch1在同一種腫瘤的不同發展階段或不同病理類型中作用不同,不但可表現為致癌作用,還可表現為抑癌作用[7-10]。另有部分研究表明，宮頸癌發生早期階段Notch1為促癌作用, 晚期則為抑癌作用[11]。同樣在胃癌的諸多研究中提示Notch信號通路在胃癌的發生、發展中發揮重要作用，但存在爭議和分歧。有研究顯示Notch1在胃癌組織中表達比正常組織明顯升高，且與腫瘤的浸潤、分化程度及大小顯著相關[12-13]。另有研究提示Notch1在胃癌中表達下調，起抑癌作用，是預后良好的獨立因素[14]。因此，目前胃癌發生、發展的過程中Notch信號通路的作用和機制沒有得到明確闡明。人聯苯樣水解酶(BPHL)基因編碼絲氨酸蛋白酶家族水解酶，水解活化核苷類似物的氨基酸酯前體藥物(抗病毒藥物)為無環鳥苷，可能在解毒過程中起作用[15]。目前也還沒有發現關于BPHL與胃癌之間關系的相關研究。本研究結果表明Notch1與BPHL基因融合產物在胃癌組織、轉移淋巴結表達率較癌旁組織及正常胃黏膜明顯增加，低分化及未分化的胃癌組織中Notch1與BPHL基因融合產物表達較高、中分化的上調，在癌組織浸潤較深的T3、T4病例中檢測率明顯高于T1、T2。以上結果提示胃癌組織中Notch1與BPHL基因融合產物高表達可能參與胃癌的浸潤及轉移。研究結論與國內周寧、黃博的研究結果顯示胃癌組織中高表達Notch1受體，與患者的腫瘤預后、TNM分期、分化程度密切相關有異曲同工之處[16-17]。結合臨床中對疑難胃癌病理基因二代測序檢測到Notch1基因第34外顯子斷裂與BPHL基因第4內含子斷裂發生融合，豐度約2.0 %。該融合產物可能為Notch1第1-34部分與BPHL第5-7外顯子氨基酸結合；其中Notch1蛋白與正常蛋白相比，缺失第2 075-2 555位氨基酸，尚未曾見報道于腫瘤中，因此具體突變意義不能明確；若融合產物對Notch1蛋白功能產生影響，可能通過改變其參與的信號通路參與腫瘤發生、發展。

綜上所述，本研究通過RT-PCR及ARMS基因檢測Notch1與BPHL基因融合產物在胃癌組織、癌旁組織、轉移淋巴結及正常黏膜中的表達，結果顯示低分化、未分化、T3及T4的胃癌組織、轉移淋巴結中融合基因表達上調，提示Notch1與BPHL基因融合產物可能參與胃癌的浸潤及轉移，對胃癌的診斷和治療具有一定應用價值，但標本量較少，且Notch1與BPHL基因融合產物介導的下游通路、機制尚不明確，有待進一步擴大樣本量及更多的研究進一步檢測及驗證，為胃癌的治療提供新的靶點。