高糖飲食對果蠅發育和抗氧化能力的影響及其機理研究

文明明，趙治恒，畢 潔，戴 煌，賀艷萍，張 威，王加華，舒在習，肖安紅

（武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北武漢 430023）

糖是生命體的主要能量來源，是維持生命基本活動的重要物質[1]。同時為了增添食品風味和營養、防腐或其他功能特性，糖作為常用的添加劑被廣泛用于食品工業中[2]。隨著人們生活水平的逐步提高，高糖的奶茶、果汁等飲料受到越來越多的年輕人的青睞。2014～2019 年，我國食糖消費量由1440 萬噸提升至1580 萬噸，截止到2020 年2 月底，2019/2020榨季累計銷糖401.72 萬噸，同比增長18.9%[3]。糖的高攝入會引起嚴重的公共健康問題，如肥胖和非傳染性疾病等[4?6]。大量研究表明，添加糖攝入過量會引起多種疾病的發生，如胰島素抵抗、腎功能損害[7]、慢性血管病[8]以及心血管疾病[9]等。因此，探究高糖飲食對發育、壽命及抗氧化能力的影響具有非常重要的研究意義和實際指導作用。

為了有效研究高糖飲食對發育、壽命及抗氧化能力的影響，選擇合適的研究對象至關重要。模式生物黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）具有遺傳背景清晰、與人類70%的致病基因在進化上高度保守[10]、生存期短、繁殖量大、飼養成本低等優勢。同時，果蠅的代謝系統[11]、行為特征、生理功能和生長發育等方面與哺乳動物類似，故常應用于繁殖力[12]、衰老或壽命[13]、功能保健食品評價[14]等領域。研究發現，高糖攝入除了會縮短壽命之外[15]，還會引起果蠅胰島素抵抗和肥胖，表現為與哺乳動物相似的癥狀[16]。此外，高糖攝入量會導致果蠅出現腎臟疾病和心肌病[17]。然而，目前研究高糖飲食對果蠅壽命的影響，大多數研究只是針對果蠅的單一性別進行探討，針對綜合雌性單獨培養、雄性單獨培養及雌雄混養的條件下高糖對壽命的影響的報道較少。本文分析了不同性別培養條件下高糖對壽命的影響，考慮到交配效應對壽命的影響，并進行了雌雄混養，并進一步探討了其影響機理。

氧化應激是指當機體在遭遇不利因素刺激時，一種產生高水平活性氧和自由基的生理狀態[18]。機體存在兩類抗氧化系統，一類是酶抗氧化系統，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等；另一類是非酶抗氧化系統，包括維生素C、維生素E、谷胱甘肽、α-硫辛酸、微量元素硒（Se）等[19]。在不利的環境下，氧衍生物可以破壞核酸、脂質和蛋白質，改變氧化平衡[20]。營養狀況也能引起氧化應激，增加細胞分子反應的級聯，并改變組織的代謝狀態[21]。營養氧化應激被描述為由于營養供應不足或過量而導致的餐后抗氧化防御和促氧化負荷之間的不平衡[22]。即使在人體正常生理狀態下，營養也會引起氧化應激。飲食因素也可以作為炎癥和促氧化因素[23]。已有研究證實，高糖飲食對機體脂代謝及抗氧化能力有損[24]，與普通低硒組相比，高糖低硒組大鼠肝臟丙二醛含量、總超氧化物歧化酶活性明顯升高，而現有研究在高糖飲食對果蠅氧化應激的作用效果及機制方面的討論尚不完全。

因此，本文以模式生物——黑腹果蠅為研究對象，用含有高濃度蔗糖的培養基飼養果蠅，研究高糖對果蠅壽命、運動和抗氧化能力的影響，為今后研究高糖飲食對生物體的影響提供理論依據，有利于為人類膳食結構中的糖類成分選擇提供更合理的建議，以期為人類樹立科學健康的飲食觀念提供一定的指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑腹果蠅品系（w1118） 由清華大學果蠅中心提供；總蛋白（TP）測定試劑盒（A045-2-2）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（A003-1-2）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒（A001-1-2）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（A007-1-1） 均購自南京建成生物工程研究所。

SPL-450 生化培養箱 天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；Kimble 749540-0000 微量電動組織勻漿器 美國Kimble 公司；SCILOGEX D3024R 高速冷凍離心機 美國賽洛捷克公司；Enspire 多功能酶標儀 美國珀金埃爾默公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 果蠅的培養

1.2.1.1 培養條件 實驗中所用黑腹果蠅品系（w1118）在武漢輕工大學糧油儲藏實驗室長期飼養，培養于恒溫光照培養箱中，（25±1） ℃、光照12 h：黑暗12 h，濕度70%的條件下。

1.2.1.2 果蠅培養基配制 普通培養基的配制[25]：30 g玉米粉，30 g 紅糖，2 g 酵母，2 g 瓊脂，300 mL 的蒸餾水，100 ℃加熱配制。冷卻后，加入2 mL 丙酸，以防止霉菌生長。高糖培養基的配制，蔗糖濃度參照張曉月[26]的實驗方法：100 g 蔗糖，21 g 玉米粉，5 g 酵母，2 g 瓊脂，300 mL 蒸餾水，加熱攪拌均勻后煮沸三次。

1.2.2 果蠅生存實驗 收集普通培養基中的雌、雄果蠅，未交配，在普通培養基中單獨飼養至2 d 齡后，將雌、雄果蠅等分為兩組，分別接入高糖培養基、普通培養基中繼續飼養，每種培養基各接入3 管，每管20 頭，普通培養基中果蠅為對照組。每天在同一時間觀察統計果蠅的數目，保證培養基每隔7 d 更換一次，直到果蠅全部死亡即為實驗終止，計算平均壽命（mean lifespan, MLS），并繪制生存曲線[27]。

計算公式：

雌雄混養方法同上，每隔4 d 更換一次新鮮培養基。

1.2.3 高糖對幼蟲的化蛹與羽化的影響 在普通培養基中挑取3 d 齡普通幼蟲，分別接入含有高糖培養基、普通培養基的培養管中，每個培養管中的幼蟲數為20 頭，每種培養基各接3 管，高糖培養基為實驗組，普通培養基為對照組。觀察并記錄果蠅幼蟲到化蛹經歷的時間、幼蟲到羽化所經歷的時間、化蛹率以及羽化率。計算公式為：

1.2.4 攀爬能力的測定 利用果蠅的反趨地性行為測試果蠅的運動水平[28]。取羽化后8 h 內的果蠅，以普通培養基果蠅為對照組，高糖培養基果蠅為實驗組，分別置于培養管內（管壁7 cm 處做標記），每管果蠅20 頭（雌、雄果蠅各10 頭），適應3 min 后，輕輕晃動培養管，使果蠅落在底部，果蠅會自發向上爬，記錄10 s 到達培養管7 cm 刻度及以上果蠅的數目（A），每管果蠅至少測試5 次，兩次測試間隔至少1 min，確保每次晃動的力度相同。

攀爬指數（climbing index, CI）計算公式為：

1.2.5 果蠅體內抗氧化酶的活力及丙二醛（MDA）含量的測定 以普通培養基喂養的雄蠅為對照組，測定高糖喂養果蠅第3、18 d 以及30 d 后雄蠅體內抗氧化酶活性和丙二醛含量。此處選擇第3、18 d 以及30 d 分別代表年輕、成熟、老齡果蠅。

1.2.5.1 樣品前處理 選取部分果蠅，將其饑餓2 h，二氧化碳氣體麻醉后稱其質量，液氮處理，按照果蠅體重1:49（g/mL）的比例加入預冷的生理鹽水，進行冰浴勻漿，制備成2%的組織勻漿。并于轉速5000 r/min、溫度4 ℃、15 min 的條件下進行離心，吸取上清液，冷藏于?80 ℃冰箱備用。每組測三個生物學重復[29?30]。

1.2.5.2 相關指標的測定 取上清液按照試劑盒說明書上方法分別測定各管果蠅體內總蛋白質含量（用于計算抗氧化酶活性）、MDA 含量、T-SOD 活性、CAT 活性。

1.2.6 轉錄組測序 用普通培養基飼養的雄蠅作對照組，用高糖培養基飼養雄蠅作為實驗組，基于Illumina NovaSeq 平臺進行轉錄組測序。從整只果蠅中提取總RNA[25]，利用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，將mRNA 片段化，以mRNA 為模板反轉錄合成cDNA，連接接頭，最后進行Illumina 測序。利用Illumina 測序平臺對篩選出的差異基因作GO 富集分析（Gene Ontology），對基因具體的生物學功能和可能參與的代謝途徑進行預測分析。

1.2.7 熒光定量 先采用Trizol 法提取果蠅總RNA，再用MLV 逆轉錄酶（Invitrogen）合成cDNA。將合成的cDNA 模板稀釋10 倍，待用。qRT-PCR 反應體系：2 μL cDNA，上游、下游引物各0.5 μL，10 μL SYBR Green qPCR superMix（Takara），7 μL dd H2O。qRT-PCR 反應程序：95 ℃預熱2 min，隨后95 ℃ 10 s，50～56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，39 個循環（具體基因引物參見表1）。目的基因與內參基因（rp49）之間的相對表達量通過2?ΔCT公式計算，ΔCT=CT目標基因?CTrp49，每組實驗3 個生物學重復。用Student’st檢驗來統計基因表達量之間的差異性，P<0.05 為差異顯著。

表1 實驗中所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.3 數據處理

實驗數據表示為平均值±標準差。采用GraphPad Prism 7.0 和SPSS 20.0 作圖和數據分析，用t-檢驗和單因素方差分析其顯著性，生存實驗采用Log-rank 檢驗來評估壽命的顯著性。以P<0.05為差異具有統計學意義，chi-square 表示卡方檢驗，df 表示自由度，n 表示樣本數。

2 結果與分析

2.1 高糖對果蠅壽命的影響

2.1.1 高糖對雌性果蠅壽命的影響 通過給果蠅飼喂高糖培養基，結果發現，糖攝入量過高會在一定程度上縮短雌性果蠅的平均壽命。與對照相比，高糖組雌性果蠅平均壽命由44.70 d 縮短到29.05 d，縮短了35.01%（表2，P<0.01）；而生存曲線沒有顯著差異（圖1, chi-square= 3.39, df=1,P=0.0656；n=60）。此外，還發現，無論是對照組還是高糖組果蠅，雌性果蠅的平均壽命顯著高于雄性果蠅的平均壽命，這與前人的研究結果類似[31]。

圖1 雌性果蠅壽命曲線Fig.1 Life span curve of female Drosophila melanogaster

表2 高糖對果蠅壽命的影響Table 2 Effect of high sucrose on life span of Drosophila melanogaster

2.1.2 高糖對雄性果蠅壽命的影響 高糖縮短了雄性果蠅的平均壽命，與對照組相比，高糖組雄性果蠅平均壽命由34.62 d 縮短到19.73 d（表2，P<0.01），縮短了43.01%。同時，高糖組的生存曲線具有極顯著差異，中位生存期極顯著縮短，即高糖組累計生存率為50%時所對應的生存時間較對照組顯著縮短，說明了攝入過多的糖會導致雄果蠅壽命縮短（圖2,chi-square=10.36, df=1,P=0.0013；n=60）。

圖2 雄性果蠅壽命曲線Fig.2 Life span curve of male Drosophila melanogaster

2.1.3 高糖對雌雄混養果蠅壽命的影響 高糖縮短了雌雄混養果蠅的平均壽命，與對照組相比，高糖組雌雄混養果蠅平均壽命由32.83 d 縮短到21.62 d，縮短了34.15%（表2，P<0.05）。同時，高糖組的果蠅中位生存期、最高壽命均極顯著縮短（圖3, chisquare=31.82, df=1,P<0.0001；n=60）。

圖3 雌雄混養果蠅壽命曲線Fig.3 Life span curve of mixed Drosophila melanogaster

2.2 高糖對果蠅化蛹與羽化的影響

果蠅的一個完整的生活周期分為4 個明顯的時期，即卵、幼蟲、蛹、成蟲。化蛹是指昆蟲在幼蟲和成蟲之間的一個發育階段，也是幼蟲轉變成為成蟲過程的過渡時期。羽化是昆蟲脫去蛹殼變為成蟲的過程，即成長為成蟲的過程。果蠅的化蛹和羽化均為果蠅生長發育的重要生理過程。與對照組相比，高糖組的果蠅化蛹所需時間延長，化蛹率和羽化率均顯著降低（表3，P<0.05），高糖組的化蛹率為75.00%±0.05%，對照組的化蛹率為95.00%±0.03%；高糖組的羽化率為70.00%±0.05%，對照組的羽化率為90.00%±0.03%，化蛹率和羽化率均降低了20%左右。

表3 高糖對幼蟲化蛹與羽化的影響Table 3 Effect of high sucrose on pupation and eclosion of Drosophila melanogaster

2.3 高糖對果蠅攀爬能力的影響

果蠅在一個垂直的空間內會自發向上運動，即具有反趨地性行為，果蠅攀爬能力實驗就是利用果蠅這種特性，測試果蠅的運動能力。對照組果蠅的攀爬指數為81.75%±0.04%，高糖組果蠅的攀爬指數為65.25%±0.05%，果蠅的攀爬能力顯著降低（圖4，P<0.05），說明當攝入糖過量時，果蠅的運動能力會降低。

圖4 高糖對果蠅攀爬指數的影響Fig.4 Effect of high sucrose on climbing index of Drosophila melanogaster

2.4 高糖對果蠅抗氧化能力的影響

2.4.1 高糖對果蠅體內T-SOD 活性的影響 高糖對果蠅體內T-SOD 活性有明顯的抑制作用（圖5）。與對照組相比，18 d 和30 d 時，高糖組極顯著降低（P<0.01）。同一培養環境下的果蠅，第3、18 d 和第30 d 時相比，隨著培養時間的延長，其T-SOD 活力值有所下降。即30 d 齡比3 d 齡和18 d 齡果蠅體內T-SOD 活力有所降低，即清除氧自由基的能力有所降低，這一結果與邵嬋[32]的研究結果相符合，40 d 齡果蠅體內SOD 活力低于25 d 齡的果蠅。

圖5 高糖對果蠅體內T-SOD 活性的影響Fig.5 Effect of high sucrose on T-SOD activity in Drosophila melanogaster

2.4.2 高糖對果蠅體內CAT 活性的影響 高糖在一定程度上降低了果蠅體內CAT 活性（圖6）。不論是3、18 d 還是30 d 的果蠅，高糖組果蠅體內CAT活性均顯著低于對照組果蠅（P<0.01）。同一培養環境下的果蠅，隨著培養時間的延長，其CAT 活力值有所下降。由圖可知，30 d 齡與3 d 齡果蠅相比，體內的CAT 活力受到抑制，即清除氧自由基的能力降低。

圖6 高糖對果蠅體內CAT 活性的影響Fig.6 Effect of high sucrose on CAT activity in Drosophila melanogaster

2.4.3 高糖對果蠅體內MDA 含量的影響 實驗結果表明，高糖在一定程度上增加了果蠅體內丙二醛MDA 含量（圖7）。與對照組相比，高糖處理第3、18 和30 d 果蠅體內MDA 含量極顯著增加（P<0.001）。這說明，糖攝入量過高會導致果蠅抗脂質過氧化反應的能力降低，果蠅的抗氧化能力也減弱。與此同時，同一高糖培養環境下的果蠅，第30 d 時較3、18 d 時相比，其MDA 含量有所升高，這也說明隨著日齡的增加，雄性果蠅抗氧化能力逐漸減弱，這與健康成年人體內MDA 的變化相似[33]，成年人隨著年齡的增大，機體內MDA 含量也隨之增加。

圖7 高糖對果蠅體內MDA 含量的影響Fig.7 Effect of high sucrose on MDA content in Drosophila melanogaster

2.5 轉錄組測序與熒光定量驗證

通過轉錄組測序，與對照組果蠅相比，如圖8 所示，高糖組有269 個基因上調表達，447 個基因下調表達（差異倍數大于等于2 倍，P<0.05）。進一步，對篩選出的差異基因作GO 富集分析（圖9），對這些差異基因按照分子功能、細胞組分和生物學過程分類。結果發現，大部分差異表達基因參與代謝過程、細胞過程生物調控及應激反應等，例如與水解DNA、凋亡細胞降解過程相關的脫氧核糖核酸酶DNaseII基因，與谷胱甘肽合成相關的GstE7 與GstD5 基因、與電子呼吸鏈相關的mt:ND4L基因。經過富集分析發現，有57 個差異表達基因與果蠅發育過程相關，有227 個差異表達基因與機體代謝活動相關。通過熒光定量PCR 進一步驗證了部分基因的表達量。如圖10 所示，與對照組果蠅相比，DNaseII與mt:ND4L基因出現下調表達（P<0.01），提示高糖果蠅可能是由于有氧呼吸或細胞凋亡途徑損傷而影響果蠅生長發育；而GstE7 與GstD5 基因出現上調表達（P<0.01），說明果蠅氧化應激異常可能也與果蠅發育受阻相關。

圖8 表達量差異基因的火山圖Fig.8 The volcano of differential expression genes

圖9 差異基因的GO 功能注釋分類統計圖Fig.9 GO functional classification on differential expression genes for each pairwise

圖10 差異基因的qRT-PCR 驗證Fig.10 Results of DEGs in qRT-PCR

3 討論與結論

本研究以果蠅為對象，探明了高糖飲食對果蠅發育、壽命及抗氧化能力的影響。首先，生存實驗結果表明，高糖飲食導致果蠅壽命顯著縮短，這與其它學者研究結果一致。Lushchak 等[34]發現，雌性果蠅食用2%～20%的蔗糖，與食用相同濃度的果糖或葡萄糖的果蠅相比，平均壽命縮短了13%～27%。另外，也有研究者用含有不同比例的糖/蛋白培養基喂養果蠅，結果顯示，改變二者的比例對果蠅壽命有明顯的影響，糖和蛋白的比例搭配合理能夠健康延壽，比例失衡會導致短壽[35]。唐潤東等[36]通過對雌性黑腹果蠅飼喂不同糖分的食物，發現糖分含量的高低密切影響著雌蠅的體質量和壽命，對中腸干細胞形態和分布影響較小。適當減少糖攝入量能夠減緩果蠅體質量增長，延長壽命。以上研究均表明糖分控制對果蠅的發育十分重要。

另一方面，化蛹與羽化實驗結果表明，高糖降低了果蠅的化蛹率和羽化率，說明了高糖抑制果蠅的發育。Rovenko 等[16]發現與對照組相比，在高蔗糖培養基中果蠅幼蟲消耗食物量減少，蛹化速率減慢，蛹的死亡率增加。同時，本文轉錄組數據也證明，在高糖組中，部分與發育相關基因出現了差異表達。

果蠅體內SOD 活性、CAT 活性、MDA 含量與果蠅的衰老存在一定的相關性。SOD 和CAT 是一類具有抗氧化能力的酶，這類酶能夠有效清除體內的活性氧自由基并使脂質過氧化反應減少，從而延緩衰老，因此，SOD 和CAT 二者活性水平的高低可以間接反應生物體清除氧自由基的能力強弱[37]。MDA是自由基對不飽和脂肪酸引發的脂質過氧化作用而產生的脂質過氧化產物，通常作為機體脂質過氧化程度的指標，可以間接反映生物活性氧的變化以及細胞損傷的程度[38]。衰老的自由基理論是1956 年由Harman 提出的[39]。隨后，也有研究表明，衰老與機體的氧化損傷有著非常密切的關系，歸因于在機體代謝過程中產生的活性氧沒有及時清除而造成的損傷累積[40]。本研究結果表明，高糖飲食導致果蠅壽命和抗氧化能力顯著下降，其原因可能由于機體代謝過程中產生過量的自由基，導致機體內正常的自由基代謝失衡，引起氧化損傷加劇。這與另一項研究結果一致，與對照組比較，高糖組大鼠H9C2 心肌細胞超微結構存在嚴重損傷，細胞凋亡程度升高，細胞氧化應激損傷指標8-羥基脫氧鳥苷和硝基酪氨酸水平升高，細胞ROS 水平升高，抗氧化酶SOD2、CAT、GPx 的mRNA 和蛋白水平表達降低，SOD2 酶活性降低[41]。研究人員在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）上觀察到與果蠅類似的現象。朱國麗等[42]通過基因芯片測序，以秀麗隱桿線蟲為實驗對象，研究高糖對線蟲壽命的影響，實驗表明，線蟲壽命會因糖攝入過多而縮短，同時線蟲的氧化應激蛋白GST-4 表達量增加。這一結果與本研究結果類似，在高糖組中，氧化應激基因GstD5、GstE7 出現了上調表達，從而引發了果蠅氧化應激異常。另外，與氧化呼吸電子傳遞鏈相關的mt:ND4L基因表達量下調，說明高糖組果蠅可能是由于有氧氧化途徑存在缺陷而導致果蠅生長發育受到影響。

綜上，本文以黑腹果蠅為研究對象，探討高糖飲食對果蠅發育、壽命及抗氧化能力的影響。結果表明，高糖飲食會導致果蠅壽命縮短，抑制了果蠅的發育和運動能力。果蠅體內T-SOD、CAT 抗氧化酶活力降低，清除自由基的能力減弱，MDA 含量增加，體內脂質過氧化損傷增加。通過轉錄組測序，發現高糖組果蠅的差異表達基因富集在果蠅發育過程、機體代謝活動調控及應激反應等方面從而縮短果蠅壽命。