養殖可口革囊星蟲纖溶酶分離純化及酶學特性研究

蔡彬新，周逢芳,3，阮少江，黃偉卿,3，劉聰穎，蘇 愉

( 1.寧德師范學院 生命科學學院，福建 寧德 352100； 2.海西海洋特色生物種質資源與生物制品開發公共服務平臺，福建 寧德 352100; 3.閩東水產品精深加工福建高校工程研究中心，福建 寧德 352100 )

血管內血栓是心臟血管疾病的主要原因，嚴重危害人體健康[1]。在某些特定的生理條件下，機體纖溶作用效率低，血管內纖維蛋白積聚，阻礙血液流動[2]。目前臨床使用的抗血栓藥物主要有抗血小板藥物、抗凝劑和溶栓劑等[3-4]。然而，這些藥物成本高、作用時間短、缺乏特異性、具有毒性及其他各種副作用[5-6]。因此，人們正在積極尋找各種來源的新型纖溶酶。據報道，目前已從海洋動物[7-9]、微生物[10-11]中分離出纖溶酶。

海洋作為人類藥物的重要寶庫，海洋藥物具有結構新穎、活性高、副作用低等優點。海洋底棲動物可口革囊星蟲(Phasclosomaesculenta)被稱為海洋“冬蟲夏草”，具有活血強身及補腎益智等功效[12-13]。Ge等[8,14-15]研究發現，可口革囊星蟲腸內存在纖溶酶，具有開發前景。由于野生可口革囊星蟲日趨減少，而對表達出的星蟲纖溶酶蛋白活性不理想[16]，限制了星蟲纖溶酶的開發。隨著星蟲養殖技術的突破，星蟲資源充足，研究養殖可口革囊星蟲體內纖溶酶活性有重要意義。筆者自養殖的可口革囊星蟲體內分離純化纖溶酶，進一步研究其酶學特性，為養殖可口革囊星蟲纖溶酶的開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

養殖可口革囊星蟲來自寧德宏遠水產有限公司星蟲養殖場。

凝血酶、纖維蛋白原、尿激酶購于Sigma公司；Q-Sepharose Fast Flow、Sephcry1 S-100購于GE公司；Bradford試劑盒購于碧云天公司；蚓激酶購于長春國奧藥業公司；其余藥品為分析純，購于國藥試劑公司。

1.1.2 儀器

AKTA蛋白層析系統(美國GE公司)；FDU-2110冷凍離心機(日本東芝公司)；Varioskan LUX酶標儀(美國Thermo公司)；凍干機FDU-1200(日本東京理化)；3-16PK高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；電泳裝置(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 纖溶酶活性測定

參照文獻[17]纖維蛋白平板法測定纖溶酶活性。以標準尿激酶活性的對數為橫坐標，以溶圈面積的對數為縱坐標，制作纖溶酶活性標準曲線，計算纖溶酶的活性。

1.2.2 蛋白質含量測定

參照試劑盒采用Bradford法測定蛋白質含量。

1.2.3 星蟲纖溶酶活性部位篩選

將星蟲洗凈剖開取食道、腸、體液3部分，冷凍干燥。用Tris緩沖液(0.02 mol/L，pH 7.5)配成10 mg/mL的液體，取10 μL于平板內進行活性檢測，陰性對照為Tris緩沖液，陽性對照為10 mg/mL的蚓激酶，確定星蟲纖溶酶活性部位。

1.2.4 星蟲纖溶酶分離純化

1.2.4.1 硫酸銨鹽析

取腸組織，加入一定體積的Tris緩沖液，勻漿，4 ℃、10 000 r/min(離心半徑13.5 cm)離心10 min，取上清液，平均分為9份，每份10 mL，加入不同質量的固體硫酸銨，飽和度分別至10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%，緩慢攪拌均勻，4 ℃靜置過夜，離心收集沉淀，用截留分子質量為5 ku的透析袋透析除鹽，測定纖溶酶活性和蛋白質含量，確定最佳硫酸銨鹽析質量分數。

1.2.4.2 Q-Sepharose Fast Flow層析

取最佳范圍鹽析所得粗酶，用Tris緩沖液配成10 mg/mL的溶液，加載到Q-Sepharose Fast Flow柱上(1.5 mm×20 cm)，Tris緩沖液平衡，分別用濃度為0.1、0.2、0.3、0.5 mol/L NaCl的Tris緩沖液洗脫結合蛋白，流速為1 mL/min，收集蛋白洗脫峰，測定纖溶酶活性和蛋白質含量。

1.2.4.3 Sephcry1 S-100凝膠層析

將Q-Sepharose Fast Flow分離出活性較高的酶，加載到Sephcry1 S-100柱上(1.0 mm×40 cm)，用Tris緩沖液洗脫，洗脫速度1 mL/min，收集蛋白洗脫峰，測定纖溶酶活性和蛋白含量。

1.2.5 相對分子質量及MALDI-TOF MS測定

采用SDS-PAGE電泳法測定星蟲纖溶酶的純度及相對分子量。分離膠含量12%，濃縮膠含量5%，上樣量為20 μL，濃縮膠電壓100 V，分離膠電壓120 V。純化得到纖溶酶PK，經切膠，送上海鹿明生物科技有限公司進行MALDI-TOF質譜鑒定，檢索美國國立生物技術信息中心數據庫。

1.2.6 星蟲纖溶酶酶學性質研究

用Tris緩沖液(0.02 mol/L，pH 7.5)配置10 mg/mL纖溶酶溶液，考察pH、溫度、金屬離子對酶活性的影響。在pH 3、4、5、6、7、8、9、10及37 ℃條件下孵育1 h，孵育后將所有樣品的pH均調為7.5，測殘余纖溶酶活性。將10 mg/mL纖溶酶分別于4、37、50、60、70 ℃下孵育1、2、3、4、5 h后，測殘余纖溶酶活性。于10 mg/mL纖溶酶溶液中加入Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Al3+，使其含有0.15 mol/L的金屬離子。以不加金屬離子的纖溶酶溶液作為對照組，37 ℃孵育1 h后，測殘余纖溶酶活性。

1.2.7 星蟲纖溶酶對體外凝血塊的溶解作用

小鼠斷頭取血，體外制備血凝塊。稱量質量后放入試管中，隨機分為9組，以生理鹽水為陰性對照組，蚓激酶(10 mg/mL)為陽性對照組，10 mg/mL星蟲纖溶酶為試驗組，每組反應1、2、3 h。按血凝塊質量分別加入等質量溶液，置37 ℃水浴，輕輕振蕩，定時觀察凝血塊溶解現象，計算溶解率(R，%)。

R=(m1-m2)/m1×100%

式中，m1為試驗前血塊質量(g)，m2為試驗后血塊質量(g)。

2 結果與分析

2.1 纖溶酶活性標準曲線

以標準尿激酶活性對數為橫坐標，溶圈面積對數為縱坐標作圖(圖1)。標準曲線方程為：y=0.3118x+1.8346，r2=0.9973，依此方程計算纖溶酶活性。

圖1 尿激酶標準曲線Fig.1 The standard curve of urokinase

2.2 不同部位勻漿液纖溶酶活性

用纖維蛋白平板檢測不同部位勻漿液纖溶酶活性，結果見圖2。體液、腸和食道3個部位中，腸勻漿液中溶圈最大，表明腸組織中纖溶酶活性最強，纖溶酶主要存在于星蟲的腸部位中。

圖2 可口革囊星蟲不同部位纖溶酶活性Fig.2 Fibrinolytic activity of different parts of sipunculid P. esculenta1.陰性對照； 2.陽性對照； 3.體腔液； 4.腸； 5.食道.1.negative control； 2.positive control； 3. coelomic fluid; 4.intestine; 5.esophagus.

2.3 星蟲纖溶酶分離純化

星蟲纖溶酶初提液經10%～90%飽和度硫酸銨鹽析，沉淀的纖溶酶活性見圖3。硫酸銨飽和度小于20%時，沉淀的纖溶酶活性很??；飽和度在40%～70%時，沉淀的纖溶酶活性隨著飽和度的增加而快速增加；飽和度大于70%時，纖溶酶活性開始減弱。因此，確定用40%～70%的飽和度硫酸銨進行鹽析。

圖3 纖溶酶鹽析曲線Fig.3 Salting out curve of the fibrinolytic enzyme

鹽析出的粗酶液經Q-Sepharose Fast Flow層析的結果見圖4。4個洗脫峰中，第4峰具有較大纖溶活性。收集第4峰活性峰，經S-100凝膠層析結果見圖5。2個洗脫峰中，第1峰具有纖溶活性，收集活性的峰1，為纖溶酶。根據尿激酶標準曲線，計算酶活性，結果見表1。從腸勻漿液分離出的纖溶酶，酶活性為4343.12 U/mg，是粗提物酶活性的13.82倍，但總酶活性回收率只有3.83%。

圖4 Q-Sepharose FF交換層析 Fig.4 Lon-exchange chromatography on Q-Sepharose FF

圖5 Sephcry1 S-100凝膠過濾層析Fig.5 Gel chromatography on Sephcry1 S-100

表1 可口革囊星蟲纖溶酶分離純化結果

2.4 纖溶酶純度及相對分子質量測定

纖溶酶分離純化的各組分經SDS-PAGE電泳，結果見圖6。40%～70%飽和度硫酸銨鹽析后的蛋白條帶較多，Q-Sepharose Fast Flow層析后有3個明顯的條帶，而經Sephacryl S-100 凝膠層析后只剩1個條帶，分子質量為32 ku。純化到的纖溶酶經MALDI-TOF質譜分析和美國國立生物技術信息中心數據庫比對，未找到相似的蛋白酶。

圖6 不同分離組分電泳Fig.6 Electrophoretogram of different components1.maker； 2.S-100層析； 3.QS-FF層析; 4.鹽析； 5.粗提物.1.maker; 2.S-100 chromatography; 3.QS-FF chromatography; 4.salting out; 5.crude extract.

2.5 星蟲纖溶酶的酶學性質

2.5.1 溫度對星蟲纖溶酶活性的影響

纖溶酶PK在4 ℃和37 ℃保溫5 h，酶的活性基本保持不變(P>0.05)(圖7)；在50 ℃時，隨著保溫時間的延長，殘余的酶活性顯著降低(P<0.05)，5 h后僅剩23.12%；在60 ℃保溫1 h后，殘余酶活性只剩27.41%；70 ℃時酶幾乎完全失活。說明該纖溶酶有一定的熱穩定性，但對高溫較敏感。

圖7 溫度對纖溶酶PK活性的影響Fig.7 Effect of temperature on activity of fibrinolytic emzyme PK柱狀圖上不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同.Different letters in the same column indicate significant differences (P<0.05), et sequentia.

2.5.2 pH對星蟲纖溶酶活性的影響

該纖溶酶活性在pH 6～9保持相對穩定，殘留酶活性在90%以上，最適pH為7(圖8)。當pH小于6或大于9酶活性均顯著下降(P<0.05)；當pH為3時，相對酶活性降至10.2%，當pH為10時，酶完全失活，說明該酶在堿性環境下更易失活。

圖8 pH對纖溶酶PK活性的影響Fig.8 Effect of pH on activity of fibrinolytic emzyme pK折線圖上不同字母表示差異顯著(P<0.05).Different letters in the same column indicate significant differences (P<0.05).

2.5.3 金屬離子對星蟲纖溶酶活性的影響

Mg2+能提升該纖溶酶的活性(P<0.05)，Fe2+、Cu2+、Al3+顯著抑制該酶的活性(P<0.05)，其他離子沒有明顯的促進或抑制作用(P>0.05)(圖9)。

圖9 金屬離子對纖溶酶PK活性的影響Fig.9 Effect of metal-ions on activity of fibrinolytic emzyme pK

2.6 星蟲纖溶酶體外溶解血凝塊

生理鹽水組各時間點血凝塊溶解率無顯著變化(P>0.05)，陽性對照組和纖溶酶組隨著時間的增長，血凝塊溶解率增大，陽性對照組在3 h時溶解率達到100%，而纖溶酶組最大為88.09%(圖10)。陰性和陽性對照組溶液呈鮮紅色，而纖溶酶組呈暗紅色(圖11)。

圖10 纖溶酶PK體外溶解血凝塊結果Fig.10 Effects of thrombolysis of fibrinolytic emzyme PK in vitro柱狀圖上不同小寫字母表示同一組不同時間差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示不同組別同一時間差異顯著(P<0.05).Different letters in the same column indicate significant differences in the same group at different time (P<0.05). differentt capital letters in the same column indicate significant differences in the different groups at the same time (P<0.05).

圖11 星蟲纖溶酶PK體外溶解血凝塊現象Fig.11 The phenomenon of thrombolysis in fibrinolytic emzyme PK of sipunculid in vitroa.陰性對照組； b.陽性對照組； c.纖溶酶PK組.a.negative control group; b.positive control group; c.fibrinolytic emzyme PK group.

3 討 論

3.1 星蟲纖溶酶活性部位選取

自然界中存在著許多具有溶栓效應的天然活性物質。溶栓藥蚓激酶上市以來，人們不斷在尋找纖溶活性強、藥理作用廣、穩定性好、副作用小的溶栓藥。海洋作為人類藥物的重要寶庫，目前已從可口革囊星蟲[14-16]、裸體方格星蟲(Sipunculusnudus)[17-19]等海洋生物中分離出纖溶酶。但野生星蟲等海洋生物資源有限，過度采挖，資源已經越來越少。目前可通過蛋白表達技術產生大量目標蛋白酶，但研究發現，原核表達的纖溶酶沒有活性，而真核系統表達的酶活性很小[16]，只能以養殖星蟲為原料提取纖溶酶。本試驗中，養殖可口革囊星蟲不同組織中腸組織纖溶酶活性最強，食道提取液活性較小，因此纖溶酶主要存在腸道中，可能與腸是主要的消化器官且內含豐富的消化酶有關。

3.2 星蟲纖溶酶純化工藝

為得到高純度的纖溶酶，以純化步驟少、操作過程低溫為原則，采用鹽析、Q-Sepharose Fast Flow陰離子和Sephcryl S-100凝膠層析組合的分離方法，從養殖可口革囊星蟲腸中分離到纖溶酶。在鹽析過程中，要邊加硫酸銨邊攪拌，以免硫酸銨沉淀及局部鹽度升高使酶失活。鹽析的關鍵是鹽含量區間的設置，既要考慮蛋白的回收率，也要考慮酶的高活性。本試驗中，硫酸銨飽和度40%～70%沉淀區間，纖溶酶活性急劇上升，此區間為鹽析目的酶的最優區間。馬伏寧等[9]用30%～70%飽和度的硫酸銨從方格星蟲中鹽析出纖溶酶；李冠龍等[20]用40%～70%飽和度的硫酸銨從茶樹菇子實體中鹽析出纖溶酶，可以看出，纖溶酶的來源不同，但鹽析的區間較為一致，這可能與纖溶酶蛋白的特性相關。

離子交換層析是蛋白純化常用的方法，影響純化效果的因素主要有填料類型、緩沖液的含量及pH等。本試驗中，筆者采用Q-Sepharose Fast Flow強離子吸附劑填料。已報道的纖溶酶蛋白等電點在4～7間，因此用pH 8.5的緩沖液進行洗脫，通過Q-Sepharose Fast Flow分離，取得了較好的分離效果。此步驟酶總活性回收率為14.65%，損失較多，可能是纖溶酶蛋白未完全吸附到填料上，直接洗脫流失，還有可能是洗脫出的目標峰溶液經過脫鹽處理后流失，后期可進一步優化緩沖液pH和洗脫流速等參數。凝膠層析作為蛋白分離純化的精細步驟，Sephcryl S-100分離后，回收率為3.83%。經過上述純化工藝路線，得到的活性為4343.12 U/mg，比腸勻漿原液酶的活性提高了13.82倍，與牛榮麗等[14]研究相比，總酶活性回收率偏低。這可能是由純化時原樣品總量較少，且鹽析含量范圍選擇的不夠寬及離子層析參數不夠恰當等導致，后期需進一步優化。

3.3 星蟲纖溶酶特性及溶血能力

牛榮麗等[14,21-23]從不同動物中純化得到的纖溶酶，其分子質量為32～35 ku，與本試驗分離到的纖溶酶分子質量32 ku相似。雖然纖溶酶蛋白分子質量與其他學者研究的相似，但通過MALDI-TOF質譜分析和美國國立生物技術信息中心數據庫比對，未找到相似的蛋白，因此后續試驗要進一步確定蛋白的序列。研究發現，纖溶酶在pH 6～9時，穩定性較好；pH超過9時，酶活性快速下降。常溫下酶活性相對穩定，但不耐高溫，與之前研究過的動物纖溶酶的pH相當[14]，適用于人體。反應體系中含有Mg2+時，纖溶酶的酶活性表現為激活作用，而在張雪等[24]的研究中，Mg2+對豆豉纖溶酶起抑制作用?？梢?，同一種金屬離子對不同的纖溶酶會產生不同的作用。體外溶解血凝塊發現，分離到的纖溶酶溶解血凝塊的能力與蚓激酶相當，但溶解出的血液顏色變深，原因待后續進一步探究。本試驗中，從養殖可口革囊星蟲腸組織中純化出的纖溶酶，與從野生星蟲等其他動物中分離出的具有同等性質及功效，為養殖可口革囊星蟲纖溶酶的開發應用，提供了豐富的原料資源。

4 結 論

自可口革囊星蟲腸中分離出1種纖溶蛋白酶，其分子質量約32 ku，活性為4343.12 U/mg；該酶在37 ℃以下及pH 6～9，酶穩定性較好；Mg2+能提升該纖溶酶的活性，Fe2+、Cu2+、Al3+可抑制酶活性；該酶對體外血凝塊溶解率達到88.09%。