低氘水聯合富血小板血漿對糖尿病大鼠胰島細胞的保護作用及TGF-β1表達的影響

趙超然 王湘琦 熊愛兵

[摘要]目的：觀察低氘水（Deuterium-depleted water，DDW）聯合富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）對糖尿病大鼠胰島細胞保護作用及TGF-β1表達的影響，初步探討其對保護糖尿病大鼠胰島細胞、促進糖尿病潰瘍愈合的可能機制。方法：通過高糖高脂飼料喂養配合腹腔注射鏈脲菌素（STZ）+背部皮膚全層切除建立糖尿病大鼠潰瘍模型。成模后按隨機數字法分為糖尿病模型組、低氘水組（DDW）、富血小板血漿組（PRP）和低氘水聯合富血小板血漿組（DDW+PRP）?？瞻讓φ战M采用腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液+背部皮膚全層切除建模。各組大鼠分別于治療后3d、7d、14d檢測隨機血糖，創面愈合率。胰腺組織HE染色后觀察其病理學改變，酶聯免疫吸附法檢測創面組織TGF-β1表達情況。結果：DDW組、DDW+PRP組干預14d后隨機血糖較干預前降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。DDW組、PRP組、DDW+PRP組在干預7d、14d后創面愈合率高于糖尿病模型組，差異具有統計學意義（P<0.05）;DDW+PRP組在干預14d時創面愈合率高于DDW組、PRP組，差異具有統計學意義（P<0.05）;且與空白對照組相比，差異無統計學意義（P>0.05）。胰島組織學觀察隨干預時間延長，DDW組、DDW+PRP組較前相比，胰島細胞在形態、數量、排列方式、染色顆粒分布情況均有明顯改觀。DDW+PRP組干預后7d、14d后TGF-β1含量高于DDW組、PRP組，差異具有統計學意義（P<0.05）;而DDW組、PRP組相比差異無統計學意義（P>0.05）。結論：低氘水聯合富血小板血漿對2型糖尿病大鼠潰瘍創面的愈合有顯著促進作用，且低氘水對2型糖尿病大鼠胰島細胞具有一定保護和修復作用。促進創面愈合機制可能與降低糖尿病大鼠隨機血糖，改善胰島細胞功能，提高創面組織中TGF-β1含量有關。

[關鍵詞]低氘水;富血小板血漿;糖尿病;胰島細胞;潰瘍創面;轉化生長因子β1

[中圖分類號]R587.1? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）06-0101-06

Effects of Deuterium-depleted Water Combined with Platelet-rich Plasma on Islet Cell Protection and TGF-β1 Expression in Diabetic Rats

ZHAO Chao-ran，WANG Xiang-qi，XIONG Ai-bing

（Department of Plastic and Burn Surgery，Affiliated Hospital of Southwest Medical University，National Key Clinical Construction Specialty，Luzhou 646000，Sichuan，China）

Abstract： Objective? To observe the effect of deuterium-depleted water （DDW） combined with platelet-rich plasma （PRP） on the islet cell protection and TGF-β1 expression in diabetic rats， and explore its possible mechanism to protect islet cells of diabetic rats and promote the healing of diabetic ulcer. Methods? The ulcer model of diabetic rats were established by feeding high-sugar and high-fat feed combined with intraperitoneal injection of streptozotocin （STZ）+full-thickness resection of back skin. After modeling， they were divided into diabetes model group， deuterium-depleted water group （DDW）， platelet-rich plasma group （PRP） and deuterium-depleted water combined with platelet-rich plasma group （DDW+PRP） according to random numbers. The blank control group was modeled by intraperitoneal injection of citric acid-sodium citrate buffer+full-thickness resection of the back skin.Rats in each group were tested for random blood glucose and wound healing rate 3d， 7d， 14d after treatment. The pathological changes were observed after HE staining of pancreatic tissue.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the expression of TGF-β1 in wound tissue. The pathological changes were observed. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the expression of TGF-β1 in wound tissue. Results? The random blood glucose in the DDW group and DDW+PRP group after 14 days of intervention was lower than before， the difference was statistically significant （P<0.05）. The wound healing rate of the DDW group， PRP group， and DDW+PRP group was higher than the diabetes model group after 7d and 14d intervention （P<0.05）. The wound healing rate of the DDW+PRP group was higher than DDW group and PRP group （P<0.05）， and compared with the blank control group， the difference was not statistically significant （P>0.05）. With the extension of the intervention time， compared with the previous groups， the islet cells in the DDW group and DDW+PRP group were significantly improved in their morphology， number， arrangement， and distribution of stained particles. The content of TGF-β1 in the DDW+PRP group was higher than the DDW group and PRP groups at 7d and 14d after intervention （P<0.05）， but there were no significant difference between the DDW and PRP groups （P>0.05）. Conclusion? Deuterium-depleted water combined with PRP can significantly promote the healing of ulcer wounds in type 2 diabetic rats， and deuterium-depleted water can protect and repair the islet cells of type 2 diabetic rats. The mechanism of promoting wound healing may be related to reducing the random blood glucose of diabetic rats， improving the function of islet cells， and increasing the content of TGF-β1 in the wound tissue.

Key words： deuterium-depleted water; platelet-rich plasma（PRP）; diabetes; islet cells; ulcer wounds;? transforming growth factor-β1

據世界衛生組織報道，目前全球約4.22億糖尿病患者，預計到2045年將達到6.93億[1]。糖尿病患者在病程中可能會發展成糖尿病足潰瘍，較小的皮膚傷口可引起慢性難愈性潰瘍，并最終導致感染、壞疽甚至截肢[2]，產生巨大的社會和經濟負擔[3]。糖尿病潰瘍創面血管生成受損，生長因子水平下降，募集炎性細胞到創面的趨化能力降低，創面血管化不良和慢性炎癥狀態限制了糖尿病足潰瘍的愈合能力[4]。目前治療主要目標是閉合傷口。在大多數情況下，換藥和清創術在內的常規療法無法獲得令人滿意的結果，目前迫切需要促進糖尿病足潰瘍愈合的新策略[5]。天然水中氘和氫的比例（D/H）約1：6 600，即氘的體積分數為0.015%，通常氘濃度低于0.015%的水稱低氘水（Deuterium-depleted water，DDW）[6]，其抗氧化、抗抑郁、抗腫瘤、降低血糖等生物學效應可用于治療相關疾病[7-8]。前期學者報道低氘水對糖尿病大鼠損傷的胰島β細胞具有減輕和修復作用[9]。富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）是全血經離心提取出的富含高濃度血小板、白細胞、纖維蛋白等血小板濃縮物。相關學者研究發現PRP對糖尿病慢性潰瘍創面的愈合有獨特優勢，能顯著促進愈合[10]。所以本次實驗擬觀察低氘水聯合富血小板血漿對2型糖尿病大鼠胰島細胞的保護作用及對潰瘍組織愈合影響。

1? 材料和方法

1.1 實驗動物：健康清潔級雄性SD大鼠120只，體質量（180±10）g，由遼寧長生生物股份有限公司提供，許可編號SCXK（遼）2015-0001。動物飼養于室溫20℃～25℃，相對濕度50%～70%條件下。本次研究經西南醫科大學動物倫理委員會審核同意，倫理編號：2020376。

1.2 主要試劑和儀器：鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）、水合氯醛、葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸三鈉（北京索萊寶公司）;大鼠TGF-β1 Elisa試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）;大鼠普通飼料（成都達碩生物科技有限公司）;大鼠高糖高脂飼料（北京科奧協力有限公司）;羅試血糖儀+試紙（活力型）;高速冷凍離心機（eppendorf 德國）;移液器（Finnpipette，20～200μl 上海金瑞科學儀器有限公司）;電熱恒溫箱（武漢-恒蘇凈科學儀器有限公司，37℃）;酶標儀（Rayto，RT-6100，450nm）;ZMX-998B型酶標洗板機;低氘水由瀘州哈羅德健康科技有限公司提供;Image Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件（Media Cybernetics美國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及模型制備：健康清潔級雄性SD大鼠120只適應性喂養1周后，隨機數字法分為空白對照組20只，糖尿病組80只，取血組20只（不參與造模及分組）。分別稱取各組大鼠體重，檢測每組大鼠尾靜脈血糖?？瞻讓φ战M大鼠普通飼料喂養4周，糖尿病組大鼠高糖高脂飼料（67%維持飼料+10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+2.5%膽酸鈉）喂養4周。造模前各組大鼠禁食12h，不禁飲。

空白對照組大鼠腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（與糖尿病組等體積），7d后采取斷尾取血法測大鼠隨機血糖。以7%水合氯醛腹腔注射（0.5ml/100g）麻醉，麻醉后大鼠固定于大鼠固定架，備皮、消毒，背部標記后制作面積大小為3cm×3cm創面，創面組織深達筋膜層，造模成功后隨機選取18只空白對照組大鼠。數碼相機拍照后無菌紗布覆蓋創面，膠布固定。

糖尿病組大鼠予以單次腹腔注射30mg/kg的1%鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶液（0.1mmol/L pH4.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，低溫、避光、臨用前配制），注射后繼續高糖高脂飼料喂養7d。7d后采取斷尾取血法測大鼠隨機血糖，隨機血糖≥16.7mmol/L標志2型糖尿病大鼠模型建立成功。血糖不達標者3d后再次腹腔注射10mg/kg的1%鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）溶液，7d后再次檢測血糖，隨機血糖≥16.7mmol/L標志造模成功[11]。模型鼠予以7%水合氯醛腹腔注射（0.5ml/100g）麻醉，麻醉后大鼠固定于大鼠固定架，備皮、消毒，背部標記后制作面積大小為3cm×3cm創面，創面組織深達筋膜層。數碼相機拍照后無菌紗布覆蓋創面，膠布固定。將造模成功的72只大鼠按隨機數字法分為糖尿病模型組、DDW組、PRP組及DDW+PRP組，每組各18只。

1.3.2 富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）的制備：每次從取血組取3～4只SD大鼠，稱重后以7%水合氯醛腹腔注射（0.5ml/100g）麻醉，每只大鼠在直視下從腹主動脈取血約10ml，用預先裝有ACD抗凝劑（1ml檸檬酸葡萄糖溶液）的真空離心管及一次性取血針提取全血，充分搖勻，取1ml全血做血小板計數為628×109。采用改良Landesberg法制作富血小板血漿，第1次離心在4℃和200g離心15min，離心后離心管血液分為3層，上層為上清液，中間層富含血小板，下層為紅細胞層。在富含血小板層與紅細胞層下方2mm處標記，用移液器提取標記線上全部液體，轉移到另一空白離心管中后搖勻。第2次離心在4℃和500g離心10min，離心后液體分為兩層，上層為貧血小板血漿（Platelet-poor plasma，PPP），下層為含有大量血小板、血漿和少量紅細胞的混合物即PRP，用移液器移除貧血小板血漿層，剩余即為PRP。經全血細胞計數測得血小板計數4 163×109。

1.3.3 干預方法：空白對照組，0.9%氯化鈉溶液灌胃，飲用普通水，潰瘍局部消毒后0.9%氯化鈉溶液紗布包扎;糖尿病模型組，0.9%氯化鈉溶液灌胃，飲用普通水，潰瘍局部消毒后0.9%氯化鈉溶液紗布包扎;DDW組，低氘水灌胃，飲用低氘水，潰瘍局部消毒后0.9%氯化鈉溶液紗布包扎;PRP組，0.9%氯化鈉溶液灌胃，飲用普通水，潰瘍局部消毒后涂抹PRP再用無菌紗布包扎;DDW+PRP組，低氘水灌胃，飲用低氘水，潰瘍局部消毒后涂抹PRP再用無菌紗布包扎。大鼠灌胃劑量均為0.01ml/g/d。各組大鼠均單只單籠飼養，潰瘍創面換藥1次/天，PRP隔日涂抹于潰瘍創面（劑量為100μl每個創面），更換清潔墊料1次/天。

1.4 觀察指標

1.4.1 隨機血糖：各組大鼠造模成功后，分別在未干預，干預后3d、7d、14d采用斷尾取血法檢測隨機血糖水平。

1.4.2 創面愈合率：分別于造潰瘍創面后（未干預），干預后3d、7d、14d對創面采取圖像，使用Image Pro Plus6.0專業圖像分析軟件測量創面面積，計算創面愈合率。創面愈合率=（干預前創面面積-干預后創面面積）/干預前創面面積×100%。

1.4.3 胰腺組織觀察：分別于造潰瘍創面后3d、7d、14d，各組抽簽法隨機選取6只大鼠，麻醉后迅速摘取完整胰腺組織，4%甲醛固定、脫水、石蠟包埋切片、蘇木精-伊紅染色、封固，普通光學顯微鏡下觀察胰島組織病理學改變。

1.4.4 潰瘍創面組織TGF-β1的檢測：分別于造潰瘍創面后3d、7d、14d，各組隨機選取6只大鼠，測隨機血糖后麻醉，取潰瘍創面及創周5mm組織2～3塊。立即置入液氮降溫，放入-80℃冷凍保存。采用酶聯免疫吸附法檢測潰瘍創面組織中TGF-β1表達量，過程嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.5 統計學分析：采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2? 結果

2.1 大鼠一般情況及體質量變化：空白對照組大鼠反應靈敏，精神好，毛發光澤，皮脂厚，體重增長快。與空白對照組相比，糖尿病模型鼠毛發粗糙，光澤度下降，色黃，易脫落，出現多飲、多食、多尿癥狀，反應遲鈍，活動度差，抓起時排便反射明顯，體重增長慢。

2.2 各組大鼠血糖水平變化：空白對照組、糖尿病模型組、PRP組大鼠隨機血糖在干預3d、7d、14d與干預前比較差異無統計學意義（P>0.05）;DDW組、DDW+PRP組大鼠在低氘水干預后隨機血糖開始緩慢下降，干預14d時與干預前相比隨機血糖降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3 各組創面大體情況及創面愈合率比較：干預3d，各組大鼠大體觀察創面無明顯縮小，部分大鼠創面可見散在皮島，創緣見不同程度滲出、水腫及少量出血，糖尿病模型組大鼠部分創緣間隙下可見少許膿性分泌物;干預7d，各組大鼠創面縮小肉眼可見，部分創面覆蓋薄層痂殼，創面可見少許肉芽組織，滲出、水腫較前相比均有不同程度改觀，皮島數量較前增多，空白對照組程度最高，糖尿病模型組最低，隨著時間推移各組大鼠創面均在逐步愈合;干預14d，空白對照組、DDW組、PRP組、DDW+PRP各組創面顯著縮小，創面滲出、水腫明顯消退，部分創面干燥結痂，愈合良好。糖尿病模型組大鼠創面明顯縮小，創面仍有少量滲出，創面水腫較前減輕，愈合程度低于其他各組。見圖1。

干預3d時，糖尿病模型組、DDW組、PRP組、DDW+PRP各組創面愈合率均明顯低于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;DDW+PRP組創面愈合率高于糖尿病模型組，差異有統計學意義（P<0.05）;糖尿病模型組、DDW組、PRP組兩兩比較差異不具有統計學意義（P>0.05）。各組愈合順序為空白對照組>DDW+PRP組>PRP組>DDW組>糖尿病模型組。

干預7d時空白對照組創面愈合率高于糖尿病模型組、DDW組、PRP組、DDW+PRP組，差異有統計學意義（P<0.05）;糖尿病模型組創面愈合率低于DDW組、PRP組、DDW+PRP組，差異有統計學意義（P<0.05）;DDW組、PRP組、DDW+PRP組兩兩比較差異不具有統計學意義（P>0.05）。各組愈合順序為空白對照組>DDW+PRP組>PRP組>DDW組>糖尿病模型組。

干預14d時空白對照組創面愈合率高于糖尿病模型組、DDW組、PRP組，差異有統計學意義（P<0.05）;糖尿病模型組創面愈合率低于DDW組、PRP組、DDW+PRP組，差異有統計學意義（P<0.05）;DDW+PRP組創面愈合率高于DDW組、PRP組，差異有統計學意義（P<0.05）;DDW+PRP組創面愈合率雖低于空白對照組，但兩者比較差異無統計學意義（P>0.05），此時創面愈合率達到高峰。各組愈合順序為空白對照組>DDW+PRP組>PRP組>DDW組>糖尿病模型組。見表2、圖2。

2.4 各組大鼠胰島組織學改變：大鼠胰腺組織HE染色光學顯微鏡下觀察，空白對照組大鼠胰島數量多，未見胰島破壞，胰島細胞數量多，且排列均勻緊密，細胞之間界限清楚，細胞質均勻淡染，胞核清晰呈橢圓形，核仁可見。干預后3d，糖尿病模型組、DDW組、PRP組、DDW+PRP組與空白對照組相比，胰島數量減少，體積變小，邊界不清，部分可見毛細血管基膜下玻璃樣變物質沉著，島內細胞排列稀疏，胞漿空泡樣變增多，細胞質著色淺，胞核固縮，部分細胞核脫失，染色質分布不均、邊集。

干預后7d，DDW組、DDW+PRP組較前干預前相比，胰島細胞數量稍增加，體積縮小，細胞排列結構較干預前有所改觀，細胞間邊界較前清晰，胞漿空泡樣變減少，染色顆粒分布稍有改觀，胰島周圍淋巴細胞浸潤減少。

干預后14d，DDW組、DDW+PRP組較前干預前相比，胰島細胞數量增加，細胞排列均勻，邊界清晰可見，胞漿空泡樣變明顯減少，胞質均勻淡染，胞核清晰，染色質分布均勻，胰島周圍淋巴細胞浸潤減少。隨干預時間延長，胰島細胞在形態、數量、排列方式、染色顆粒分布情況均有明顯改觀。

干預后3d、7d、14d，糖尿病模型組、PRP組大鼠胰島組織受損較重、胰島細胞體積增大，細胞間排列明顯紊亂、邊界不清，多數胞漿呈空泡樣變或疏松網狀，染色顆粒分布不均，部分細胞核固縮、脫失，胰島周圍淋巴細胞浸潤較多，較前相比均無明顯改觀。見圖3～4。

2.5 對各組大鼠創面組織TGF-β1的影響：糖尿病模型組、DDW組、PRP組、DDW+PRP組大鼠創面組織中TGF-β1含量在3d、7d、14d均低于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;而DDW組、PRP組及DDW+PRP組大鼠在干預后3d、7d、14d含量較糖尿病模型組升高，差異有統計學意義（P<0.05）。PRP組在干預后3d與DDW組相比含量升高，差異有統計學意義（P<0.05），在干預后7d、14d兩者差異無統計學意義（P>0.05）。DDW+PRP組在干預后3d與PRP組比較差異無統計學意義（P>0.05）;DDW+PRP組在干預后7d、14d創面組織中TGF-β1含量較DDW組、PRP組明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3，圖5。

3? 討論

創面愈合是一個復雜而有序的生物學過程，包括初期損傷及快速止血期、炎癥期、增殖期、成熟期等階段，在正常機體協調下愈合過程呈高度有序性及完整性[12]。糖尿病創面延遲愈合與神經血管病變及多種生長因子低表達相關，胰島素抵抗及高血糖狀態進一步延遲愈合。PRP是全血經離心提取出的富含高濃度血小板、白細胞、纖維蛋白等血小板濃縮物?；罨蟮难“寤罨擃w粒釋放TGF-β、PDGF、IGF、EGF、VEGF等多種生長因子，其相互協同作用促進細胞增殖與分化，加速血管生成及組織修復[13]。近期研究證實在創面愈合受損的組織中TGF-β1表達下降[1]，與這些觀察結果一致，本次觀察到糖尿病模型組大鼠創面組織TGF-β1的低表達，PRP組、DDW組糖尿病大鼠TGF-β1蛋白表達水平升高，與同期糖尿病模型組相比，創面肉芽組織生成增多，滲出、水腫消退較快，創面愈合率顯著提升。且DDW+PRP聯合干預組大鼠與單一干預組相比，TGF-β1表達量、創面愈合率屬同期最高。目前已發現TGF-β1參與了創傷愈合的各個過程，如細胞外基質（ECM）的合成、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達和成纖維細胞的分化。在皮膚損傷后活性TGF-β1能刺激成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，其特點是與受損前相比α-SMA的高表達[14]。此外，TGF-β1協同促進成纖維細胞對膠原的收縮，從而加速傷口愈合[15]。Tsai等[16]報道激活后的PRP內含大量纖維蛋白，相互交織形成網狀結構形成生物支架，牽拉創緣向創面中心移動，使修復過程快速而有效。實驗中發現經低氘水干預后的大鼠，TGF-β1蛋白水平、創面愈合率均升高，與富血小板血漿干預組相比兩者差異不具有統計學意義。

低氘水具有抗氧化，抗抑郁，抗腫瘤，降低血糖等一系列生物學效應，可用于治療相關疾病[7-8]。Zlatska等[17]發現DDW對離體人真皮成纖維細胞的增殖能力具有刺激作用，具有更高的增殖潛能。研究表明[7]DDW能提高12周齡Wistar-Kyoto大鼠胰島素水平并降低血液中甘油三酯、膽固醇水平。在另一項研究中發現飲用DDW的大鼠血漿中糖蛋白總量及其糖基化程度均顯著降低[18]。周振宇等[9]發現低氘白酒能降低糖尿病大鼠空腹血糖水平，提高空腹血清胰島素水平;組織學觀察顯示低氘白酒具有減輕及修復損傷的胰島β細胞。本實驗研究發現經低氘水干預的糖尿病大鼠TGF-β1蛋白水平上升，創面愈合率與糖尿病模型組相比升高，愈合速度加快，在14d時隨機血糖下降明顯。推測可能與減輕胰島素抵抗、增加胰島素分泌有關。胰腺組織HE染色顯示，隨干預時間的推進，胰島細胞在形態、數量、排列方式、染色顆粒分布情況均有不同程度改觀。說明低氘水具有保護及修復受損胰島細胞，降低糖尿病大鼠隨機血糖水平，加速糖尿病大鼠潰瘍創面愈合。本次實驗DDW組、PRP組在TGF-β1蛋白水平、創面愈合率，兩者差異均不具有統計學意義。而DDW+PRP組在TGF-β1蛋白表達上提升最明顯，在干預14d時與DDW組、PRP組相比創面愈合程度最高，差異具有統計學意義。

綜上，低氘水聯合富血小板血漿能降低2型糖尿病大鼠隨機血糖水平，對胰島細胞具有一定保護和修復作用，能顯著促進潰瘍創面的愈合，可能與提高創面組織中TGF-β1蛋白含量有關，具體機制有待進一步研究探討。

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[收稿日期]2020-11-05

本文引用格式：趙超然，王湘琦，熊愛兵.低氘水聯合富血小板血漿對糖尿病大鼠胰島細胞的保護作用及TGF-β1表達的影響[J].中國美容醫學，2021，30（6）：101-106.