蛋雞輸卵管炎造模方法的篩選與驗證

朱永明 王倩 宋玉卓 郗艷菊 郭永紅 范開

摘 要：為了篩選蛋雞輸卵管炎造模方法，采用30%苯酚膠漿和大腸桿菌、沙門氏菌混合菌液分別對健康蛋雞進行造模，通過觀察造模后蛋雞的精神狀態、輸卵管病理切片、酶聯免疫吸附法檢測炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量對造模效果進行評價。結果表明，30%苯酚混合明膠、甘油注入蛋雞子宮部可造成輸卵管炎，表現為不安，喜臥，站立不直，被毛凌亂，產蛋困難，黃白色分泌物增多;其所產的雞蛋蛋殼表面出現血跡，有大小不等的顆粒;輸卵管被覆上皮增厚，嗜中性粒細胞浸潤，并有彌漫的趨勢;血清中IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量均顯著高于對照組（P<0.05）;而大腸桿菌、沙門氏菌混合菌液造模不會導致輸卵管炎，與對照組相比無差別。本試驗結果顯示，30%苯酚膠漿導入輸卵管子宮部可以建立良好的輸卵管炎模型，優于大腸桿菌和沙門氏菌的混合菌液模型。

關鍵詞：蛋雞;輸卵管炎;造模;驗證

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：B文章編號：1673-1085（2021）10-0005-06

收稿日期：2021-08-20

*基金項目：河北省功能性飼料添加劑技術創新中心建設補助經費（217790537H）。

作者簡介：朱永明（1992-），女，河北滄州人，碩士，研究方向為微生物學，E-mail：779546000@qq.com;并列第一作者：王倩（1991-），女，河北石家莊人，學士，研究方向為制劑工藝研究，E-mail：406299391@qq.com。

**通訊作者：郗艷菊（1981-），女，河北滄州人，碩士，研究方向為動物營養，E-mail：149697628@qq.com。

輸卵管炎是威脅蛋雞健康的常發病之一，影響蛋雞生產性能的發揮，多發生于初產蛋雞、高產蛋雞[1，2]。當蛋雞處于產蛋期，輸卵管每天都高負荷工作，難免會出現問題;尤其是雞舍環境不潔凈造成大腸桿菌、沙門氏菌等病原菌容易由泄殖腔侵入輸卵管引發輸卵管炎，會使產蛋率下降5%～30%，主要造成蛋殼品質的下降[3、4]，嚴重影響養殖戶的經濟效益。

為了更好地研究蛋雞輸卵管炎，本試驗對輸卵管炎的造模方法進行篩選，模擬輸卵管炎的發病情況，篩選出最佳輸卵管炎造模方法，并通過對蛋雞精神狀態、輸卵管組織切片以及炎癥因子雞白介素2（IL-2）、雞白介素6（IL-6）、雞腫瘤壞死因子（TNF-α）、雞γ干擾素（IFN-γ）含量進行評價，以對造模后輸卵管炎進行驗證，為后續治療蛋雞輸卵管炎藥物的臨床應用奠定基礎。

1 試驗材料

1.1 試劑

大腸桿菌、沙門氏菌由實驗室分離自臨床商品蛋雞輸卵管炎病例;苯酚膠漿由中國農業大學動物醫學院實驗室自制;伊紅-蘇木精購自上海山浦化工有限公司;IL-2試劑盒（E-EL-Ch0120c）、IL-6試劑盒（E-EL-Ch0228c）、TNF-α試劑盒（E-EL-Ch0215c）、IFN-γ試劑盒（E-EL-Ch0026c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

LB培養基、LA培養基按照微生物學實驗教程[5]進行配置。

1.2 試驗動物及分組

試驗雞是處于高產期的白萊航蛋雞，90羽，隨機分為3組，分別為空白組30羽、大腸桿菌與沙門氏菌混合菌液組30羽、苯酚膠漿組30羽。

1.3 主要儀器

MB-530酶標分析儀，深圳市匯松科技發展有限公司;MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋，SANYO;AUW120D電子天平，SHIMADZU;THZ-98AB恒溫振蕩器，上海一恒科學儀器有限公司;JB-CJ-2FD潔凈工作臺，蘇州佳寶凈化工程設備有限公司;SPX-150B-Z型生化培養箱，上海博遠安業有限公司。

2 試驗方法

2.1 混合菌液制備

用滅菌過的接種環挑取斜面上的大腸桿菌、沙門氏菌，將菌種接種于LA培養基上，37 ℃培養24 h進行活化，然后分別挑取菌落接種到裝瓶量50 mL/300 mL的LB液體培養基中，180 r/min、37 ℃培養18 h，采用10倍法平板計數估算菌液濃度，分別將大腸桿菌和沙門氏菌菌液濃度調至2×109 cfu/mL，然后3：2混合，備用。

2.2 30%苯酚膠漿制備

參考文獻[6、7]進行改進，稱取30 mL 液化苯酚、5 g明膠、20 mL甘油，加蒸餾水至100 mL，置于錐形瓶中，密封保存，備用。

2.3 建模

建模方法參考姬曉琪的方法[6]：取出試驗雞，至于解剖臺上，使其仰臥保定，左手握住兩側跖部，掌心緊貼著蛋雞的龍骨突，使蛋雞背部靠緊解剖臺，泄殖孔朝上;右手母指和食指分開附于泄殖孔下方的羽毛，輕輕地向下按壓，可見泄殖腔泄殖道背側寬大的輸卵管口，另一人將藥劑導入距輸卵管口2～3 cm處即可。

試驗前，每天早晚兩次正常飼喂，直至蛋雞產蛋率穩定在80%以上后開始建模;空白組（A組）不做處理，苯酚膠漿組（B組）注射1 mL的苯酚膠漿，混合菌液組（C組）注射1 mL的混合菌種培養液。

2.4 觀察及檢測指標

2.4.1 觀察蛋雞精神狀態 觀察蛋雞產蛋量以及異常蛋情況。

2.4.2 病理學觀察 建模48 h后每組取3只蛋雞進行放血和剖檢，觀察氣囊和卵巢組織的變化情況，并取卵巢及輸卵管組織進行切片制作。

石蠟切片制作及HE染色流程[8]：固定→沖洗→修塊→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→貼片→烘片→復水→染色→脫水→透明→封片。

2.4.3 酶聯免疫吸附試驗 取全血在37 ℃條件下放置1 h（不加抗凝劑），4 ℃冰箱過夜，當血清自然析出后，以 4℃、3000 r/min離心10 min，分離血清，棄去不溶物，將血清移至一干凈離心管，-80 ℃保存備用，參考試劑盒說明書步驟進行血清中的炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平檢測。

2.4.4 統計分析 采用SPSS 18.0軟件進行數據統計分析，結果采用“平均值±標準差”，以P<0.05為差異顯著性判斷。

3 結果

3.1 建模后蛋雞的臨床表現

采用30%的苯酚膠漿對白萊航蛋雞建模后，蛋雞表現為不安，喜臥，站立不直，被毛凌亂，產蛋困難，黃白色分泌物增多，使泄殖孔周圍的羽毛浸入分泌物，泄殖腔有糞便沾染，其所產的雞蛋蛋殼表面出現血跡，有大小不等的顆粒;而混合菌液組則與空白對照組臨床表現一致，二者在蛋雞外觀及雞蛋表面無明顯差別，蛋雞表現站姿正常，羽毛干凈有光澤，泄殖腔無糞便沾染，產蛋順暢，蛋形正常，表面光潔。剖解后，苯酚膠漿組蛋雞氣囊透明，卵巢正常，卵泡排列有序，輸卵管子宮部呈紫紅色，炎癥反應明顯;混合菌液組與空白對照組的內臟器官均無明顯病變。三組的蛋雞外觀和雞蛋表面變化見圖1、圖2。

3.2 組織病理學結果

空白對照組的輸卵管子宮部組織結構完整，層次清晰，細胞組成正常（圖3，A）。苯酚膠漿組輸卵管被覆上皮增厚，嗜中性粒細胞浸潤，并有彌漫的趨勢（圖3，B）?；旌暇航M的輸卵管結構與空白對照組相似，未見炎癥特征（圖3，C）。苯酚膠漿呈現良好的建模效果，優于混合菌液建模。

3.3ELISA檢測炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量變化

由表1可知，B組蛋雞的血清中IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量均顯著高于空白對照組（P<0.05）且具有統計學意義;C組蛋雞的血清中IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量與空白對照組相比無明顯差異;B組蛋雞血清中的IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量均顯著高于C組（P<0.05）且具有統計學意義，說明B組即苯酚膠漿組可以引起蛋雞輸卵管炎炎癥反應。

4 討論

目前輸卵管炎造模以化學法和病原菌法的方式比較常見。化學造模法以苯酚為主，具有驗證反應快、反應明顯等優點，缺點是與臨床實際病癥不一致;病原微生物造模法以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等接種為主，具有與臨床實際病癥一致的優點，缺點是反應慢、炎癥反應不明顯。

張小麗等[9]用15%的液化苯酚，混合適量纖維素，制成苯酚糊劑進行大鼠輸卵管炎的造模，結果顯示用苯酚膠漿注入雙側輸卵管內造成大鼠輸卵管炎癥模型是成功而可行的。苯酚為常用的消毒劑的主要成分之一，使蛋白質變性，對黏膜等具有強烈的腐蝕性，可對輸卵管黏膜形成損傷，破壞黏膜的防御功能，從而使定植于泄殖腔的條件性致病微生物侵染而造成輸卵管炎。而自然發病的蛋雞輸卵管炎亦是蛋雞因產蛋頻繁，輸卵管分泌長期處于旺盛狀態，當身體條件特別是溫度、濕度、營養等因素發生變化時，部分敏感雞只出現與上述相似情況，條件致病微生物突破黏膜屏障，造成炎癥反應。

歐陽紫婷等[10]以大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌按2∶1∶1比例配制成濃度約為3×109 cfu/mL的混合菌，從外陰道插入直達子宮底部注射，對70只大鼠進行輸卵管炎的造模，結果顯示有50只大鼠造模成功。而禽類與哺乳動物不同，其消化系統、生殖系統和排泄系統在泄殖腔泄殖道匯合，產卵頻繁造成輸卵管口無法完全閉合，幾乎完全開放于泄殖腔，泄殖腔中常在微生物群落復雜、豐富，可以隨時進入輸卵管中，其中大腸桿菌數量較多，因此，在黏膜屏障狀態良好時導入混合菌液無法造成相應的效果，因此單純導入混合菌液無法建立炎癥模型。

炎癥在病原體入侵或組織損傷后被激活，在生理上起著保護宿主正常功能的作用，炎性細胞因子是指參與炎癥反應的各種細胞因子，主要的炎性細胞因子包括IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ[11，12]。TNF-α和IFN-γ是在機體免疫網絡中起調節作用的重要因子，IL-2和IL-6含量可反映機體免疫功能的強弱[13]。姬曉琪[6]用25%的苯酚膠漿注射進入蛋雞子宮部，觀察發現蛋雞坐立不安，疼痛，產出帶血跡的蛋，通過檢測炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量發現顯著高于未造模組，輸卵管病理切片發現有中性細胞浸潤，說明用苯酚膠漿可以成功建立蛋雞輸卵管模型。

5 結論

30%苯酚混合明膠、甘油導入輸卵管子宮部可以建立良好的輸卵管炎模型，優于大腸桿菌和沙門氏菌的混合菌液模型。30%苯酚膠漿法造?？梢鸬半u輸卵管的炎癥反應，是一種可靠的蛋雞輸卵管炎造模方法。

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Screening and Verification of Modeling Methods for Layer Salpingitis

ZHU Yongming1，3，4，WANG Qian1，3，SONG Yuzhuo1，4，XI Yanju1，3，4*，GUO Yonghong1，3，4，FAN Kai5

（1.Hebei Weierli Animal Pharmaceutical Group Company Ltd， Shijiazhuang Hebei? ?050227， China;

2.College of Life Sciences， Hebei Agricultural University， Baoding Hebei? ?071001， China; 3.Hebei Province Functional Feed Additive Technology Innovation Center，Shijiazhuang Hebei 050227， China;

4.Shijiazhuang Animal Functional Additive Engineering Technology Research Center， Shijiazhuang Hebei? ?050200， China;

5.China Agricultural University，Beijing? ?100193， China）

Abstract： In order to screen the methods of modeling salpingitis in laying hens， 30% phenol glue and mixed bacterial liquid of Escherichia coli and Salmonella were used to model healthy laying hens. The effect of modeling was evaluated by observing the mental state of laying hens， pathological sections of fallopian tubes， and detecting the content of inflammatory factors IL-2， IL-6， TNF-α， IFN-γ by enzyme-linked immunosorbent assay.The results showed that injection of 30% phenol mixed gelatin and glycerin into the uterus of laying hens could cause salpingitis， which manifested as restlessness， lying down， not standing straight， messy coat， difficulty in laying eggs， and increased yellow and white secretions;There were blood stains on the surface of the eggshell， which fulled of particles of varying sizes; the fallopian tube were thickened by the epithelium， infiltrated by neutrophils， and had a tendency to diffuse;The content of IL-2， IL-6， TNF-α and IFN-γ in the serum were significantly higher than the control group（P<0.05）， However， the mixed bacterial solution of Escherichia coli and Salmonella did not cause salpingitis， and there was no difference compared with the control group. The results of this test showed that the introduction of 30% phenol glue into the uterus of the fallopian tube could establish a good salpingitis model， which was better than the mixed bacterial liquid model of Escherichia coli and Salmonella.

Keywords： Laying hen; Salpingitis; Modeling; Verification