白藜蘆醇調控LINC00460/TWIST1抑制膠質母細胞瘤侵襲遷移的研究*

蔡 皞，歐陽佳，王 磊，任年軍

（1.湖南省腫瘤醫院/中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院，湖南 長沙 410013；2.吐魯番市人民醫院，新疆 吐魯番 838000）

膠質母細胞瘤又被稱為多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM），是成人最常見的顱內惡性腫瘤，約占原發性腦腫瘤的17%[1]。GBM細胞往往易于浸潤性生長，并侵襲周圍的正常腦組織，因此被認為是膠質瘤中惡性程度最高的類型[2]。這種侵襲性表型是導致GBM治療失敗和術后復發轉移的重要原因[3]。因此，進一步解析GBM這種高侵襲性表型的潛在機制，針對性開發新的治療方法將有望使患者生存獲益。

白藜蘆醇（resveratrol）是存在于葡萄、漿果、花生和葡萄酒中的一種具有丁苯結構的天然多酚[4]。同時，白藜蘆醇也是多種中藥材的有效成分，如虎杖、買麻藤、甘松等。多項研究證實，白藜蘆醇具有心血管保護、抗炎、抗衰老等生物活性[5-6]。最近的研究發現，白藜蘆醇對多種類型的癌癥顯示出強大的抗腫瘤活性。上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一個動態的細胞生物過程，以細胞失去上皮樣特性轉化為間充質表型為基本特征，在胚胎發育、創傷愈合和組織重塑等過程中起到了關鍵調控作用[7]。近年來，越來越多的研究表明[8]EMT參與到腫瘤進展過程中，與腫瘤細胞的侵襲和遷移密切相關。這提示EMT可能與GBM細胞的高侵襲性存在關聯。研究表明[9-11]，白藜蘆醇可對EMT的發生起調節作用，但具體調控機制仍未完全闡明。LINC00460是在多種腫瘤細胞中高表達的長鏈非編碼RNA基因[12]。有研究顯示LINC00460能調控EMT影響非小細胞肺癌的轉移[13]。我們發現LINC00460的表達可被白藜蘆醇抑制。因此，本研究以高侵襲轉移能力的U87MG-trans為細胞模型，探討白藜蘆醇對GBM細胞表型的影響，并考察其具體分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器GBM細胞系U87MG購自中國科學院上海細胞生物學研究所，批號：3131C0001000700138。U87MGtrans為課題組前期通過Transwell侵襲小室構建的高侵襲轉移能力的U87MG亞群[14]。胎牛血清（批號：16000044）、DMEM培養基（批號：12800017）、胰酶（批號：25200056）（Gibco公司）；TRIzol（Invitrogen公司，批號：15596026）；PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒（TaKaRa公司，批號：RR047A）；SYBRRPremix Dimer－EraserTM試劑（TaKaRa公司，批號：RR091Q）；Matrigel（BD公司，批號：356234）；ECL化學發光液（Thermo公司，批號：34094）。Forma 371型CO2培養箱（Thermo公司）；HCB-900V型超凈工作臺（海爾）；ST16R型離心機（Thermo公司）；K3型酶標儀（Thermo公司）；PowerPac型電泳儀及轉膜儀（Bio-rad公司）；IX73型顯微鏡（奧林巴斯）；LightCycler 480 II Real-Time PCR系統（Roche公司）。

1.2 在線數據分析 利用GEPIA2.0在線數據庫的生存分析模塊分析TCGA-GBM數據集中候選基因的表達與患者預后的關系。通過PEARSON相關分析模塊，分析TCGA-GBM表達數據集中目標分子間的表達相關性。

1.3 細胞培養 所有細胞培養于含有10%胎牛血清（FBS）DMEM培養基中，培養體系中添加1%的青霉素-鏈霉素，培養條件為恒溫37℃的含5%CO2的細胞培養箱。當細胞達到90%匯合時采用胰酶消化，以1∶3的比例進行傳代培養。當細胞生長至50%匯合時，采用濃度為0、20、40 μmol/L的白藜蘆醇孵育細胞，進行后續實驗。

1.4 MTT實驗 采用MTT測定細胞活力。接種細胞于96孔板中培養過夜，使用白藜蘆醇孵育細胞36h。將20μL MTT（5mg/mL）加入到每個實驗孔中孵育4 h。棄去上清液后加入DMSO，使用酶標儀在570 nm波長處檢測吸光度。

1.5 RNA提取和實時定量qPCR實驗 使用TRIzol法裂解細胞并提取總RNA。根據PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒的說明書進行逆轉錄合成cDNA。使用SYBRRPremix DimerEraserTM試劑盒在LightCycler 480ⅡReal-Time PCR系統上檢測目的基因的表達水平，相對表達量使用2-ΔΔCt法進行計算。引物序列為GAPDH-F：5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’；GAPDH-R：5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’；LINC00460-F：5’-ACATC GGAGGTACCCAGACA-3’，LINC00460-R：5’-GAAAGCTGCAACATGCTCCC-3’。

1.6 Transwell及劃痕實驗 將含有2×103個細胞的懸浮液接至涂有包被了Matrigel（以1∶7稀釋）的Transwell小室中。底部小室內加入600 μL含20%FBS的DMEM培養基。孵育48 h后，將Transwell小室在4%多聚甲醛中固定20 h，用結晶紫染色20 h，并使用顯微鏡計數穿透小室的細胞數量。在每個樣品隨機選擇5個區域進行計數，統計細胞數量。

提前1 d將細胞接種于6孔板，待其生長至100%匯合。用槍頭垂直于細胞平面，沿著直尺進行劃痕，PBS清洗掉從細胞板上脫落的細胞后，更換新鮮無血清培養基。開始記時，分別于0、24 h在顯微鏡下觀察并測量劃痕的寬度，并拍照。

1.7 蛋白質印跡實驗 提取各組細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。每個樣品取20 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，并轉膜至PVDF膜上。使用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，TBST清洗10 min×3次。一抗（1∶1 000稀釋于含5%脫脂奶粉的TBST）于4℃孵育過夜，TBST清洗10 min×3次。二抗（1∶1 000稀釋于含5%脫脂奶粉的TBST）室溫孵育1 h，TBST清洗10 min×3次。使用ECL化學發光液與膜孵育3 min，進行曝光拍照。

1.8 統計學方法 使用SPSS 23.0進行統計分析，使用GraphPad Prism 7進行數據可視化。每個獨立實驗重復3遍。計量資料以“均數±標準差”（±s）表示。兩組之間比較采用t檢驗進行分析，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 LINC00460在高侵襲性GBM細胞中高表達 我們首先檢測了不同亞群細胞里LINC00460的表達水平（見圖1），LINC00460在高侵襲轉移能力GBM細胞亞群U87MG-trans中高表達，提示該lncRNA可能與GBM細胞的侵襲轉移能力有關。通過在線數據庫生存分析發現，LINC00460高表達的GBM患者總生存期較短（見圖2）。

圖1 LINC00460在高侵襲轉移的GBM細胞中高表達s，n=3）

圖2 LINC00460高表達與GBM患者預后不良相關分析

2.2 白藜蘆醇抑制U87MG-trans細胞的侵襲遷移MTT實驗結果顯示，當使用白藜蘆醇處理細胞時，U87MG-trans細胞存活率與U87MG細胞比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖3）Transwell和劃痕實驗結果顯示，隨著白藜蘆醇濃度的增加，細胞侵襲和遷移的能力均被抑制，且呈劑量依賴性。（見圖4）

圖3 白藜蘆醇對GBM細胞增殖的影響s，n=3）

圖4 白藜蘆醇對GBM細胞侵襲、遷移能力的影響s，n=3）

2.3 白藜蘆醇抑制LINC00460的表達并阻止EMT發生 我們檢測了白藜蘆醇作用下LINC00460的表達變化。結果顯示，白藜蘆醇孵育可導致LINC00460表達降低。（見圖5）通過在線數據分析發現，LINC00460與EMT關鍵轉錄因子TWIST1的表達在TCGA-GBM表達數據集中顯著正相關（見圖6，相關系數R=0.48，P=1.3e-10）。進一步通過蛋白印跡實驗發現，白藜蘆醇可抑制LINC00460表達，過表達抑制的增加，TWIST1和間充質樣標志物Vimentin的表達顯著下調，上皮樣標志物E-cadherin的表達顯著上調。（見圖7）

圖5 白藜蘆醇抑制GBM細胞中LINC00460的表達s，n=3）

圖6 在TCGA-GBM數據集中LINC00460與TWIST的表達顯著正相關

圖7 白藜蘆醇對EMT相關蛋白的影響

2.4 過表達LINC00460可部分恢復白藜蘆醇對GBM細胞的抑制作用 在GBM細胞中瞬時轉染LINC00460過表達質粒，qRT-PCR檢測發現，LINC00460上調了5.7倍。（見圖8A）進一步研究發現，在白藜蘆醇處理的細胞中瞬時轉染LINC00460過表達質粒可部分恢復細胞的侵襲轉移能力（見圖8B、8C），提示白藜蘆醇通過抑制LINC00460的表達阻止EMT發生，進而影響GBM細胞的侵襲和轉移。

圖8 過表達LINC00460逆轉白藜蘆醇（40 μmol/L）對GBM細胞侵襲遷移的抑制作用

3 討 論

高侵襲性生長是膠質母細胞瘤的重要特征，也由此使得GBM患者的預后較差。因此，必須找到針對GBM細胞這種特性的合適藥物。與常規化療藥物相比，中藥處方往往副作用較少[15]。中藥在腫瘤輔助治療中也展示了一定的治療效果[16]。此外，多種抗腫瘤藥物為提取自植物中天然活性成分。例如從長春花葉中提取的長春新堿，治療急性淋巴細胞白血病、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤非常有效[17]。紫杉醇是從紅豆杉中直接提取出來的一種具有抗癌活性的二萜生物堿類化合物，廣泛應用于乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的治療[18-19]。然而，中醫藥及其活性提取物是否能應用于GBM的治療仍研究較少。

EMT通常在腫瘤細胞侵襲和轉移過程中被激活，與腫瘤轉移密切相關。HUANG P等[20]研究表明，GBM細胞轉移過程中可能會經歷EMT過程，從而獲得更好的細胞運動性。白藜蘆醇被證明能夠抑制GBM細胞增殖并增加細胞死亡率[21-22]。近期有研究證明，白藜蘆醇可通過調節細胞的EMT抑制胰腺癌細胞和胃癌細胞的侵襲和遷移[11,23]。但是，白藜蘆醇是否可以抑制GBM細胞中的EMT，從而降低其侵襲遷移能力尚未完全明確。在本研究中，我們的團隊發現白藜蘆醇能夠抑制GBM細胞的侵襲遷移，且在此過程中伴隨著間充質樣細胞標志物Vimentin的下調和上皮樣細胞標志物E-cadherin的上調，提示白藜蘆醇對EMT的調控影響了細胞的侵襲、遷移能力。為了進一步考察白藜蘆醇抑制GBM侵襲遷移的分子機制，我們進行了分子生物學實驗。研究發現，LINC00460在高侵襲轉移能力的GBM細胞亞群中顯著上調，且其表達可被白藜蘆醇顯著抑制。進一步生物信息學分析發現，EMT關鍵轉錄因子TWIST在GBM中的表達與LINC00460的表達顯著正相關，推測TWIST是LINC00460的下游基因。結合蛋白印跡實驗結果，我們推測白藜蘆醇可通過抑制LINC00460表達，下調TWIST從而抑制EMT，最終降低GBM細胞的侵襲、遷移能力。為證明這一推測，我們繼續進行了挽救實驗。我們發現，上調LINC00460表達可部分恢復白藜蘆醇對GBM細胞侵襲遷移能力的抑制作用，這與預期一致。本研究并未闡明白藜蘆醇抑制LINC00460表達的具體分子機制。目前已知白藜蘆醇的直接作用靶點包括PTGS1、CSNK2A1、NQO2、PTGS2等，其對LINC00460的抑制作用是通過這些直接靶點來間接調控，抑或是LINC00460能夠直接與白藜蘆醇藥物分子發生直接作用，仍需進一步研究。另外，TWIST1是EMT發生的重要轉錄因子，我們的結果推測它是LINC00460的下游基因，其具體分子機制也需要進一步的研究來闡明。

綜上所述，白藜蘆醇可抑制GBM細胞的侵襲、遷移能力。白藜蘆醇的這一作用是通過抑制LINC00460表達，從而下調TWIST介導的EMT來實現的。本研究結果可為白藜蘆醇運用于GBM的治療提供理論基礎。