基于網絡藥理學和分子對接技術探討附子-白芍配伍治療抑郁癥的作用機制*

張景霞，李莎莎，李 凡，王衛鋒，趙重博，李 芳

（1.陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫藥研究院，陜西 西安 710003）

附子-白芍配伍具有溫陽斂陰、養血緩急、調氣機等作用，最早出現于《傷寒雜病論》[1]。附子（Aconiti carmichaeli Radix Praeparata）為毛茛科烏頭屬植物，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛的功效，后世皆用其治療危重癥患者。現代研究表明附子主要化學成分有生物堿、多糖、神經酰胺等，具有強心、抗炎、鎮痛、抗衰老、抗抑郁等藥理作用[2-3]。白芍（Paeoniae Radix Alba）為毛茛科植物，具有養血斂陰、柔肝止痛的功效，化學成分有黃酮類、萜類化合物、多糖等，具有抗炎、抗氧化、抗抑郁等藥理作用，用于治療神經退行性疾病[4]。劉磊[3]研究表明附子生物堿可通過上調cAMP反應元件結合蛋白（cAMPresponse element binding protein，CREB）-腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）通路達到抗抑郁作用，同時具有促進神經元再生的作用。白芍可使海馬組織中單胺類神經遞質去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）和5-羥色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）的水平明顯升高，并且使5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindole acetic acid，5-HIAA）的水平明顯下降，達到抗抑郁的作用[5]，且其提取物及芍藥苷均具有抗抑郁作用[6-7]。

抑郁癥是一種慢性反復發作的腦疾病，臨床表現為持續的情緒低落、焦慮、睡眠障礙、思維遲鈍、興趣減退、對前途悲觀失望等，嚴重者甚至有自殺傾向[3]。隨著社會的發展，人們在生活和工作中的壓力越來越大，抑郁癥發病率逐年上升，但其發病機制尚不明確[8]。中醫認為抑郁癥屬于“郁病”，其發病機理是心神失養，體內肝氣郁結，治療抑郁癥應以疏肝理氣解郁為主[9]，還有少數醫家認為應以消痰利膽為主[10]。目前有關中藥治療抑郁癥的研究越來越多，但主要集中在單味藥和單一作用機制等方面[11]，而傳統中醫藥多是將藥材配伍使用，中藥成分復雜，治療相關疾病具有多靶點的特征。本研究利用網絡藥理學和分子對接的方法，探討附子-白芍配伍治療抑郁癥的分子靶點和機制，構建其治療抑郁癥的分子靶點網絡，為中藥復方治療抑郁癥的科學研究提供參考。

1 資料和方法

1.1 潛在活性成分及靶點篩選 檢索數據庫（TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）得到附子和白芍的化合物成分，篩選條件設定為口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，血腦屏障（BBB）≥-0.3[9]，篩選出附子和白芍的化學成分及相關靶標，并在Uniprot數據庫（http//www.uniprot.org/）將篩選出的靶點蛋白標準化。

1.2 抑郁癥靶點的獲取 檢索GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)和Disgenet數據庫（https://www.disgenet.org/）得到與抑郁癥相關的所有靶點。

1.3 附子-白芍配伍靶點與疾病靶點集Venn分析 將附子-白芍配伍主要化學成分作用靶點與疾病靶點數據集進行Venn 分析（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得出附子-白芍化學活性成分與抑郁癥的靶向關系。

1.4 網絡建立與富集分析

1.4.1 蛋白質-蛋白質互作關系（PPI）網絡圖 將得到的交集靶點在線導入String數據庫，物種設為“Homosapiens”，閾值設為中等置信度“medium confidence=0.4”，其余參數保持默認設置不變，得到蛋白與蛋白間相互作用信息，構建PPI網絡圖，利用“Network analysis”功能進行網絡的拓撲屬性分析，根據其節點度值Degree參數，明確靶點和靶點間作用關系；進而根據網絡拓撲學理論得知其在網絡中信息傳遞效率更高，能影響更多節點。

1.4.2 生物過程注釋及代謝通路分析 為了闡述附子-白芍配伍與疾病相關成分的靶點在生物過程中的功能作用機制，以R Studio軟件對交集靶點進行KEGG代謝通路分析和GO生物信息學富集，描述基因靶點的分子功能（MF）、所處的細胞位置（CC）和參與的生物過程（BP）；用KEGG數據庫富集靶點基因參與的主要生化代謝途徑，以P<0.05為顯著性差異作為判定值，對富集結果進行可視化處理，以說明附子-白芍配伍抗抑郁活性成分及參與生物途徑之間的關系，并闡明附子-白芍配伍多成分、多靶點、多途徑協同抗抑郁癥可能的作用機制。

1.5 分子對接分析 在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中得到藥材中活性化合物的3D結構；從RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）數據庫中篩選得到的核心靶蛋白的晶體結構，去除了水分子和配體小分子，分離出潛在蛋白的結構。在Discovery Studio 2016軟件中采用LibDock程序進行對接，對接空腔和大小根據化合物及蛋白質分子進行設定，其余參數保持默認，對化合物和靶標蛋白進行分子對接分析。

2 結果與分析

2.1 有效成分的搜集與篩選 根據DB、DL、BBB值篩選得到10個潛在活性成分，其中附子潛在活性成分7個，根據GeneCards和Disgenet數據庫中抑郁潛在的靶點和附子-白芍相關靶點的映射反推配伍后可能存在的有效成分共6個，相應靶點蛋白46個，活性成分的OB、DL和BBB值見表1，所對應的結構見圖1。

圖1 附子-白芍中有效化合物的結構

表1 附子-白芍中化合物的OB、DL 和BBB

2.2 疾病及藥物靶點的篩選 檢索GeneCards和Disgenet數據庫設定為“人類”，得到抑郁癥相關的基因靶點共9 785個，與附子-白芍配伍潛在靶點進行匹配，通過Venny 2.1.0映射最終得到交集靶點36個。（見圖2）

圖2 “成分-靶點”及“疾病-靶點”Venn 圖

2.3 PPI網絡建立及富集分析

2.3.1 PPI網絡 將36個交集基因名導入String數據庫，導出TSV文本，再導入Cytoscape3.7.2軟件得PPI網絡圖，共36個節點，100條邊。CASP3與其他靶點的聯系最多，其次是JUN、CHRM1、ESR1。CASP3參與Caspases的激活級聯反應，負責細胞凋亡的執行。（見圖3）

圖3 36 個關鍵靶點PPI 網絡圖

2.3.2 富集分析 采用CludterProfiler程序包對36個交集靶點基因進行GO、KEGG功能注釋和富集分析，GO富集分析中MF、CC和BP功能分析均設Pvalue Cutoff=0.05；Qvalue Cutoff=0.05并繪制條形圖。KEGG通路富集分析設定Pvalue Cutoff=0.05，篩選排名前20的通路繪制氣泡圖。（見圖4～5）

圖4 附子-白芍治療抑郁癥活性靶點GO 富集分析

GO富集分析結果表明富集主要集中在生物過程上，共433條富集結果，其中膜電位調節、肌肉系統過程、血液循環調節和肌肉收縮過程參與的基因數目最多。細胞組分中有58條富集結果，其中基因參與最多的是突觸后膜和膜筏，突觸后膜面向神經末梢的突觸前膜，由突觸裂口與之分離，神經遞質穿過突觸間隙，將信號傳遞到突觸后膜[12]；膜筏是不均勻的，高度動態的，富含固醇和鞘脂的膜結構域，將細胞分隔開[13]；分子功能中有71條富集結果，其中神經遞質受體所占比重較大，它與神經遞質結合并傳遞信號，改變細胞活動；研究表明，5-HT1A受體既是突觸前膜自身受體又是突觸后膜受體，這2種受體對5-HT系統具有相反作用，可調節其水平，發揮抗抑郁作用[8]。附子-白芍可通過調節機體的多種生物過程而發揮抗抑郁作用。

圖5 KEGG 通路富集圖

對36個靶基因進行KEGG通路富集分析，共得到67條富集結果，以P＜0.05，取排名前20的為候選信號通路，主要富集在神經活性配體-受體相互作用、5-羥色胺能突觸、γ-氨基丁酸能突觸、PI3k-Akt信號通路及雌激素信號途徑等信號通路。結果表明，附子-白芍能通過多條信號通路發揮抗抑郁作用。2.4 藥材-成分-靶點-通路網絡分析 利用Cytoscape 3.7.2中的Merge功能將“藥材-成分”“成分-靶點”“靶點-通路”網絡合并，得到“藥材-成分-靶點-通路”網路圖。網絡中粉色節點表示藥材，橙色節點表示有效成分，綠色節點表示與抑郁癥的相關疾病靶點，紅色節點表示與抑郁癥靶點相關的通路。根據網絡圖分析得知，通路神經活性配體-受體相互作用和鈣信號通路與潛在靶點存在較多的連接。此外，附子中的三角豆素和白芍中的β-谷甾醇對活性靶點SCN5A、PTGS2、ADRB2和ADRA1B均有調控作用；潛在活性靶點PTGS1和PGR連接較多的邊數；說明附子-白芍配伍是以多途徑、多環節、多靶標整體協同增效。（見圖6）

圖6 藥材-成分-靶點-通路網絡圖

2.5 分子對接分析 根據“藥材-成分-靶點-通路”網絡圖選取活性成分連接靶點數較多的化合物β-谷甾醇、三角豆素，并選擇靶點PTGS1與上述2種化合物進行分子對接，且成分β-谷甾醇、Mairin、谷甾醇均作用與PGR靶點，利用Discovery Studio 2016軟件進行對接驗證。Mairin能夠與PGR靶點中ALA211、PRO210、PHE241、TYR63等氨基酸殘基結合，產生氫鍵和共軛效應，增加了結構的穩定性，配體受體結合得分較高。β-谷甾醇能夠與LYS58、TYR63、PHE241等位點結合形成大量的氫鍵，表明親和力較好。谷甾醇與TYR63、PRO235、TYR26等位點結合。PTGS1與三角豆素、β-谷甾醇分子對接得分為110.82和109.12，表明PTGS1與附子和白芍的成分具有良好的親和力，這與“藥物—成分-靶點-通路”網絡分析結果一致，化學成分與活性位點的結合而發揮治療效果。（見表2、圖7～8）

圖7 PGR 與Mairin、β-谷甾醇、谷甾醇分子結合圖

表2 化合物與潛在靶點分子對接結合能量及得分

3 討 論

圖8 PTGS1 與三角豆素、β-谷甾醇分子結合圖

本文采用網絡藥理學的手段，篩選得到附子-白芍化合物6個，預測治療抑郁癥的潛在靶蛋白36個。網絡圖提示附子-白芍治療抑郁癥的有效化合物為三角豆素、β-谷甾醇、谷甾醇和Mairin，有效靶點為PTGS1和PGR。PPI網絡拓撲學分析結果顯示，CASP3與其他靶點的聯系最多，是細胞凋亡的主要執行者，激活下游信號調節因子促進細胞凋亡；GO富集結果顯示附子-白芍配伍主要是通過參與膜電位調節、血液循環調節、對銨離子的反應、G蛋白偶聯受體信號途徑、胞漿鈣離子濃度的調節、磷脂酶C激活G蛋白偶聯受體信號途徑及鈣離子輸運等生物過程發揮抗抑郁作用。KEGG主要富集結果提示附子-白芍抗抑郁的靶點主要集中在神經活性配體和受體相互作用、鈣信號通路、PI3K-Akt、γ-氨基丁酸能突觸和5-羥色胺能突觸等信號通路。同時，選取β-谷甾醇、三角豆素與活性靶點PTGS1對接，β-谷甾醇、Mairin、谷甾醇與活性靶點PGR對接，模擬驗證預測結果，結果顯示化合物和靶點PTGS1及PGR有良好對接活性。研究結果說明附子-白芍配伍治療抑郁癥具有多成分、多靶點、多通路協同作用特點，并使用分子對接技術得到了初步驗證。

β-谷甾醇和三角豆素與潛在靶點連接的度值較高，β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、解熱、免疫調節、止痛等作用[14]，能夠顯著提高腦內5-HT、NE和代謝產物5-HIAA，有研究表明β-谷甾醇抗抑郁活性是通過這些神經遞質介導的[15]；三角豆素具有抗炎、抗菌、抗氧化及肝保護作用[16]。研究表明氧化應激與抑郁有較大的關系[17]。

中樞神經系統中5-HT活性降低是引發抑郁的基礎，可通過5-羥色胺能突觸信號通路來升高5-HT[18]；神經活性配體-受體相互作用信號通路是質膜上所有與細胞內外信號通路相關的受體和配體的集合，可改善神經遞質傳導功能而發揮抗抑郁作用[19]；研究證明小鼠抑郁樣行為的改善作用伴隨著前額葉灰質和海馬內的基因表達差異，而這些基因主要集中在神經活性配體和受體相互作用的信號通路上；γ-氨基丁酸是一類重要的抑制性神經遞質，主要分布在腦內且含量較高，與焦慮、抑郁和失眠的發病機制有關[3]。PI3K-Akt信號通路中AKT可促進NF-κB蛋白表達，從而擾亂下丘腦-垂體-腎上腺軸功能使炎癥反應失調，將加重抑郁癥狀[20]。

本研究預測了附子-白芍配伍治療抑郁癥生物過程及通路的可行性，表明了其多靶點、多通路的治療特點，但對其關鍵生物過程和關鍵通路的調控還應進一步的深入研究，后續應進行體外細胞實驗或體內動物實驗等手段加以驗證，以確保預測結果的科學性及準確性。