基于統計學分析比較回流和超聲提取方法制備沒食子提取物的化學輪廓差異

王 亞，季志紅,2，馬 璇,2，米爾扎提·麥麥提，李柯翱，張明惠

（1.新疆奇沐醫藥研究院[有限公司]，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學，新疆 烏魯木齊 830011）

西帕依固齦液是維吾爾族傳統藥物，是一種以沒食子為原料的制劑，具有健齒固齦、清血止痛的作用。西帕依固齦液用于治療牙周疾病引起的牙齒酸軟，咀嚼無力，松動移位，牙齦出血以及口舌生瘡，咽喉腫痛，口臭煙臭[1-4]。據報道，西帕依固齦液在口腔護理中具有理想的臨床應用價值，沒食子提取物是制備西帕依固齦液的重要中間體，影響西帕依固齦液的質量評價[5-6]。沒食子為殼斗科植物沒食子樹（Quercus infectoria Oliv.）幼枝上的干燥蟲癭，由沒食子蜂科昆蟲沒食子蜂（Cynipsgallae-tinctoriae Oliv.）的幼蟲寄生而形成[7-9]。沒食子又名沒石子、墨石子、無食子等，主產于地中海沿岸、伊朗、印度等地，尤以小亞細亞產量最多，新疆地區所使用的沒食子多由巴基斯坦進口，我國無分布記載，屬外來中藥[10-13]。目前，西帕依固齦液的質量控制方法尚不完善，主要成分和活性成分的含量尚未確定，且不同提取工藝直接影響西帕依固齦液的質量，從而無法對西帕依固齦液的質量進行有效監測[14-16]。

本研究的目的是通過高效液相色譜（HPLC）法測定沒食子化學成分含量，判斷不同提取方法制備的提取物質量是否一致[17-19]；采用化學輪廓計數結合多變量統計分析方法和SPSS統計軟件開展沒食子不同提取方法的活性成分含量差異研究，從統計分析角度，為不同提取方法制備的沒食子提取物的質量評價提供基礎數據。

1 儀器與試劑

1.1 試劑 對照品沒食子酸（中國食品藥品檢定研究院，含量：90.8%，批號：110831-201605）；沒食子酸甲酯（成都普菲德生物技術有限公司，含量：98%，批號：17092604）；沒食子酸乙酯（成都普菲德生物技術有限公司，含量：98%，批號：19042902）；鞣花酸（中國食品藥品檢定研究院，含量：89.3%，批號：111959-201602）；沒食子藥材（新奇康藥業股份有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純（飛世爾實驗器材有限公司）；其他試劑均為分析純，水為純化水。

1.2 主要儀器 LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-300VDV型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；XMTD-7000型水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司）；ME55型十萬分之一電子天平（德國梅特勒－托利多儀器有限公司）；ME204T型萬分之一電子天平（德國梅特勒－托利多儀器有限公司）；GM-1.0A隔膜型真空泵（天津市津騰實驗設備有限公司）；UPT-I-20T型超純水機（四川優普超純科技有限公司）；FW135型粉碎機（北京市永光明醫療儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫條件，見表1；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：273 nm；進樣量：10 μL。沒食子對照品、不同提取方法制備及處理的樣品供試液HPLC圖譜[20-21]見圖1。

表1 梯度洗脫條件

圖1 混合對照品、供試品HPLC 圖譜

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取各種對照品適量，加甲醇制成每1 mL含沒食子酸62 μg、沒食子酸甲酯26 μg、沒食子酸乙酯及鞣花酸4 μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 超聲法制備的沒食子供試品溶液 分別稱取6批沒食子藥材粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50 mL純化水，超聲30 min，放冷，吸取1 mL，置10 mL容量瓶中，用純化水定容，即得超聲法制備的沒食子供試品溶液（A1-A6）。

2.3.2 回流法制備的沒食子供試品溶液 分別稱取6批沒食子藥材粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50 mL純化水，稱定質量，加熱回流1 h，放涼，再稱定質量，用純化水補足減失的質量，吸取1 mL，置10 mL容量瓶中，用純化水定容，即得回流法制備的沒食子供試品溶液（B1-B6）。

2.4 QC樣品的制備 采用“2.3.2”回流法制備沒食子提取物供試品溶液，取續濾液作為QC樣品。

2.5 數據采集及數據處理 選擇峰A（沒食子酸）、峰B（沒食子酸甲酯）、峰C（沒食子酸乙酯）和峰D（鞣花酸）為參照對齊樣品中各色譜峰的保留時間，檢測色譜峰，形成樣品數據集（包括樣品編號、保留時間及峰面積）。將數據導入SIMPCA-P 13.0進行主成分分析（PCA）、聚類分析（HCA）、秩和檢驗等多變量數據分析，采用SPSS 23.0統計軟件對數據進行分析，計量資料若服從正態性可采用“均數±標準差”來描述，組間比較采用方差分析，若不服從正態性可采用中位數和四分位數間距來描述，組間比較采用秩和檢驗。

2.6 HPLC分析方法的驗證 為保障6批沒食子數據的可靠性，采用QC樣品對儀器和方法的漂移程度進行評價。將QC樣品連續進樣6次，數據導入SIMPCA-P 13.0軟件中，結果見圖2。從PCA圖中可以看出QC樣品聚為一類，顯示儀器和分析方法學的重復性和精密度較好，說明數據是可靠的，可以納入后期的數據整理。

圖2 沒食子提取物（包括QC 樣品）的PCA 圖

3 結果與分析

3.1 不同提取方法制備沒食子提取物的化學輪廓差異分析 回流法和超聲法制備的沒食子提取物樣品數據扣除QC樣品的PCA打分圖，可見沒食子提取物樣品均被清晰地分為兩大類，結果表明同一樣品用不同提取條件提取存在明顯差異；且超聲法制備的樣品更為集中，即超聲法制備樣品組內差異小于回流法制備樣品，超聲法制得的沒食子提取物具有更高的均一性。（見圖3）

圖3 沒食子提取物樣品的PCA 打分圖

為評價樣品間質量差異的程度，采用HCA對PCA進行聚類分析柱狀繪圖，可以看出回流法及超聲法提取的樣品清晰的聚為2類，超聲法及回流法又分為若干類，但超聲法分類較回流法少，說明超聲法制備的樣品更為集中，組內差異更小。結果與PCA打分圖一致，表明超聲法和回流法制備的樣品化學輪廓差異明顯，質量差異顯著。（見圖4）

圖4 沒食子提取物樣品PCA 打分圖的HCA 分析柱圖

3.2 不同批次及不同提取方法制備的沒食子提取物主要有效成分含量變化分析 不同批次的沒食子藥材經過超聲法和回流法提取后發現，回流法提取的有效成分沒食子酸和沒食子酸甲酯均明顯高于超聲法（見表2）；回流法制備的沒食子提取物中沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯的含量明顯高于超聲法（P<0.01）；而回流法制備的沒食子提取物中鞣花酸的含量則明顯低于超聲法（P<0.01）（見表3）；含量測定結果表明不同提取方法對沒食子提取物中主要有效成分含量的變化有著顯著影響，兩種提取物的質量具有明顯差異。同時可以考慮增加沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯含量作為沒食子提取物的評價指標?；亓鞣ㄖ苽涞臎]食子提取物3種主要有效成分含量較超聲法高。但批次間差異過大，導致在PCA圖上顯示回流法制得樣品較為分散。

表2 不同方法不同批次制備的沒食子提取物有效成分含量測定結果（，μg/mL，n=3）

表2 不同方法不同批次制備的沒食子提取物有效成分含量測定結果（，μg/mL，n=3）

表3 不同提取方法制備沒食子提取物的差異比較 [MCP25，P75]

4 討 論

本實驗比較了兩種提取方法即回流法和超聲法制備的沒食子提取物的差異，發現兩種提取方法制備的沒食子提取物存在質量差異，并篩選出了導致差異的4個特征性化學成分（沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯和鞣花酸）；結合化學輪廓及統計分析角度對結果進行綜合分析，從統計分析角度看，兩種沒食子提取物中主要有效成分沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯、鞣花酸的含量具有明顯差異（P＜0.01），回流法制備的沒食子提取物含量高于超聲法制得的樣品；化學輪廓角度分析則顯示超聲法制備的樣品有更高的均一性，因為回流法提取的主要化學成分含量明顯高于超聲法，所以導致批次間差異過大，導致在PCA圖上顯示回流法制備的樣品較為分散；從提取工藝與臨床應用的相關性角度思考，回流法和超聲法制備的沒食子提取物，實際上存在質量差異，其化學成分含量有顯著變化，這對于以沒食子提取物為原料制備生產的臨床應用藥品品質的影響不可忽視。

研究提示在生產以沒食子提取物為原料的藥品時，應比較兩種提取方法制備的沒食子提取物質量間差異及不同處理方法對其成分的影響，并與臨床實際應用需求相結合，選擇最佳提取制備工藝，以更好地控制藥品質量，保證臨床療效[22-23]。今后的研究將深入探討不同提取工藝如溶劑等對沒食子提取物質量的影響，以期為沒食子提取物的質量控制提供更為全面的科學依據。