麒麟丸及其主要成分制何首烏對大鼠的長期肝毒性研究*

楊春燕，葉向鋒，魏金鋒，顧 磊，戴凱琴

（1.北京協和建昊醫藥技術開發有限責任公司，北京 100076；2.廣東太安堂藥業股份有限公司，上海 200080）

麒麟丸（國藥準字Z10930034）為國家中藥保護品種，具有補腎填精、益氣養血的作用，主要治療男子不育及女子不孕癥。制何首烏是麒麟丸的主要成分之一，具有補肝腎、益精血、烏須發和強筋骨等功效，主要用于治療血虛萎黃、眩暈耳鳴、須發早白及腰膝酸軟等[1]。近年來關于何首烏及其制劑引起的不良反應日益增多，其主要臨床表現為肝損傷，國內有關何首烏不良反應文獻中肝損傷約占93.47%[2-4]。雖然何首烏經過加工炮制后其肝毒性能降低，達到去毒減毒的目的[5-6]，但是仍有研究發現制何首烏會引起不同程度的肝損傷[7]。麒麟丸治療不孕不育已在臨床上廣泛使用，但關于其以制何首烏為主要成分的肝毒性卻鮮有報道。因此，本研究擬采用SD大鼠90 d連續灌胃給予麒麟丸和制何首烏提取物，考察可能出現的肝臟毒性，以期為臨床進一步合理、安全地應用麒麟丸提供參考和指導。

1 材 料

1.1 實驗動物與飼料 6～7周齡SPF級SD大鼠150只，雌雄各半，雌鼠體質量154～177 g，雄鼠體質量151～173 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK（京）2012-0001。實驗動物設施持續保持屏障環境標準，室溫（23.2±0.9）℃，相對濕度（62.5±4.1）%，最小換氣次數15次/h，光照明∶黑暗=12 h∶12 h，整個飼養過程中保持動物飲食活動自由。本實驗所用動物及相關處置符合動物福利的要求，實驗開展前經過了北京協和建昊醫藥技術開發有限責任公司實驗動物管理和使用委員會（IACUC）的審查批準，受理編號：SN13157-DC。SPF大鼠飼料由中國軍事醫學科學院動物實驗中心提供，生產許可證號：SCXK（軍）2012-0003。

1.2 藥物 麒麟丸（廣東太安堂藥業股份有限公司，批號：B20130704，規格：90 g/瓶）；制何首烏提取物（浸膏）（廣東太安堂藥業股份有限公司，批號：B20140508）；制何首烏按麒麟丸處方工藝單獨提取浸膏，每克浸膏含大黃素0.52 mg，含二苯乙烯苷13.2 mg。

1.3 試劑 丙氨酸氨基轉移酶（ALT/GPT）試劑盒（批號：140591）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST/GOT）試劑盒（批號：140531）、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（批號：140691）、尿素（UREA）試劑盒（批號：140631）、尿酸（UA）試劑盒（批號：130511）、總膽固醇（CHO）試劑盒（批號：131121）、甘油三酯（TG）試劑盒（批號：130711）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號：140551）、肌酸激酶（CK）試劑盒（批號：140561）、總蛋白（TP）試劑盒（批號：130491）、白蛋白（ALB）試劑盒（批號：140511）、肌酐（CRE）試劑盒（批號：130461）、葡萄糖（GLU）試劑盒（批號：130621）、總膽紅素（TBIL）試劑盒（批號：AUZ1005）、血清鈣（Ca）試劑盒（批號：140441）（美國貝克曼庫爾特公司）；凝血酶原時間（PT）試劑盒、活化部分凝血活酶時間（APTT）試劑盒（法國思達高公司）；滅菌注射用水（山東齊都藥業有限公司）。

1.4 主要儀器 電子天平（德國賽多利斯公司）；STA-4型半自動四通道血液凝固測定儀（法國STAGO公司）；顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；COULTERAU480型全自動生化分析儀（美國BECKMAN公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組 將150只大鼠隨機分為對照組，制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組，雌雄各半，每組30只。

2.2 制何首烏的制備 麒麟丸和制何首烏提取物所使用的藥材制何首烏采用黑豆汁拌勻潤透3～4 h，蒸制5～6 h后再保溫燜潤6～8 h，晾藥后制得。

2.3 劑量設計 麒麟丸的臨床擬用劑量為6 g/次，2～3次/d，每日劑量為12～18 g。按成人一般體質量以60 kg計，每日成人擬用劑量為200～300 mg/kg。實驗中麒麟丸低、中、高劑量組大鼠給藥量分別相當于臨床成人每日最大劑量的6.7、13.3、26.7倍，即2 000、4 000、8 000 mg/kg。制何首烏提取物組按照麒麟丸高劑量組（8 000 mg/kg）所含制何首烏計算給藥劑量，實驗中制何首烏給藥劑量354 mg/kg（0.18 mg/kg大黃素、4.67 mg/kg二苯乙烯苷）相當于臨床成人每日服用麒麟丸最大劑量中所含制何首烏的26.7倍，折合成制何首烏生藥量為8 g/kg。

2.4 給藥和取材 麒麟丸低、中、高劑量組和制何首烏提取物組灌胃給予相應藥物，大鼠給藥體積均為2 mL/100 g，對照組大鼠灌胃給予等體積蒸餾水，連續給藥90 d。給藥結束時每組分別處死20只大鼠（雌雄各半），在給藥結束后設恢復期30 d，30 d后處死各組剩余大鼠。全部大鼠腹腔注射2.0%戊巴比妥進行麻醉，腹主動脈取血后處死，進行解剖。肉眼檢查組織器官有無異常，對肝臟進行稱重，并計算肝臟指數=（肝臟質量/體質量）×100%。

2.5 一般情況觀察 觀察并記錄各組大鼠的一般情況，包括外觀體征、行為活動、腺體分泌、呼吸情況、進食狀況、體質量及體溫變化。

2.6 血液生化相關檢查 各組大鼠腹主動脈取血后，進行血液生化指標檢查，IFCC連續監測法檢測丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）；雙縮脲終點法檢測總蛋白（TP）；溴甲酚綠終點法檢測白蛋白（ALB）；計算法檢測球蛋白（GLB）、白球比（A/G）；礬酸氧化法檢測總膽紅素（TBIL）；對硝基苯膦酸二鈉連續監測法檢測堿性磷酸酶（ALP）；乳酸基質連續監測法檢測乳酸脫氫酶（LDH）；N-乙酰半胱氨酸連續監測法檢測肌酸激酶（CK）；葡萄糖氧化酶終點法檢測葡萄糖（GLU）；谷氨酸脫氫酶兩點法檢測尿素（UREA）；尿酸酶終點法檢測尿酸（UA）；苦味酸兩點法檢測肌酐（CREA）；膽固醇氧化酶終點法檢測總膽固醇（CHOL）；甘油磷酸氧化酶終點法檢測甘油三酯（TG）。另取血樣，磁珠法檢測凝血酶原時間（PT）和活化部分凝血酶原時間（APTT）。

2.7 組織病理學檢查 用10%中性福爾馬林固定，固定后逐級酒精脫水，石蠟包埋、切片。經蘇木素-伊紅染色，光鏡下進行檢查。

2.8 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。計量資料用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 各組大鼠一般情況 整個實驗期間，對照組，制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組大鼠的行為活動、外觀體征、糞便及尿液等均未見異常。

3.2 各組大鼠體質量和大鼠攝食量比較 整個實驗期間，各組雌、雄鼠的體質量均不斷增長，制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組雌、雄鼠的體質量及攝食量與對照組比較，無明顯差異。表明長期灌胃麒麟丸不會影響大鼠的體質量和攝食量。

3.3 各組大鼠肝臟指數比較 給藥結束及恢復期結束時，制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組大鼠的肝臟指數與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠肝臟指數比較（，%）

表1 各組大鼠肝臟指數比較（，%）

3.4 各組大鼠肝功能指標比較 給藥結束時，制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組雌鼠的血清生化指標與對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。麒麟丸低劑量雄鼠的A/G明顯低于對照組（P＜0.01）；麒麟丸中、高劑量組TBIL明顯高于對照組（P＜0.05）；制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組雄鼠其余血清生化指標與對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。恢復期結束時，制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組雌、雄鼠的血清生化指標與對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。（見表2～3）

表2 各組雌鼠生化指標比較（）

表2 各組雌鼠生化指標比較（）

表3 各組雄鼠生化指標比較（）

表3 各組雄鼠生化指標比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

給藥結束時，麒麟丸高劑量組雄鼠的APTT明顯短于對照組（P＜0.05），制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組雌、雄鼠其余凝血指標與對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。恢復期結束時，制何首烏提取物組和麒麟丸低、中、高劑量組雌、雄鼠的各項凝血指標與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠鼠凝血指標比較（，s）

表4 各組大鼠鼠凝血指標比較（，s）

注：與對照組比較，aP＜0.05

3.5 各組大鼠肝組織病理學改變 給藥結束時，與對照組比較，麒麟丸高劑量組和制何首烏提取物組大鼠的肝臟未見明顯與給藥相關的毒性病理改變；恢復期結束，麒麟丸高劑量組和制何首烏提取物組大鼠的肝臟未發現延遲或蓄積毒性病理改變。（見圖1）

圖1 各組大鼠肝臟病理切片圖（HE，×20）

4 討 論

麒麟丸是運用中醫學“腎主生殖”的理論，在五子衍宗丸基礎上研制的治療不孕不育的中成藥，目前在臨床上用于治療少弱精子癥等男性不育疾病[8]。已有研究顯示麒麟丸在增加患者的精子質量，優化睪丸內環境等方面具有較好的臨床療效和安全性[9-10]。涂燦等[11]對何首烏及其制劑的臨床不合理用藥方式進行分析發現，其不合理用藥主要涉及三超用藥、采用非傳統用藥方式和不恰當聯合用藥等方面。何首烏及其制劑肝損傷的臨床表現主要是黃疸、乏力、尿黃和皮膚黃等，臨床指標主要表現為ALT、AST水平升高[4]。有研究報道何首烏及制何首烏能抑制大鼠原代肝細胞的增殖，減少膽紅素的攝取及膽汁排泄，從而誘導肝細胞損傷[12]。謝麗華等[13]發現何首烏醇提物能抑制肝藥酶CYP1A2、CYP2E1、CYP3A1等亞型活性抑制，減慢機體代謝速度，增高血藥濃度或引起蓄積，導致藥物不良反應的發生，引起肝損傷。因此，本研究為探索麒麟丸和其所含制何首烏的毒性，故增加制何首烏提取物組。

本研究中，麒麟丸低、中、高劑量組及制何首烏提取物組總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、凝血酶原時間（PT）等反映了肝細胞蛋白合成代謝功能的正常；谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）等也說明肝細胞未受到損傷；總膽紅素（TBIL）等指標也反映肝臟排泄、分泌及解毒功能正常。同時病理組織也顯示肝臟均未見明顯損傷。

麒麟丸（2 000～8 000 mg/kg）及制何首烏提取物（354 mg/kg）長期應用對大鼠無明顯肝臟毒性，可能與制何首烏的蒸制、燜潤時間較長有關。何首烏經炮制后其毒性減少，但是炮制方法、時間對何首烏成分及肝毒性均有影響[14]。制何首烏為中藥材何首烏的炮制加工品，有黑豆汁蒸制法和清蒸法，同時采用常壓或高壓蒸制[15]。王燕青等[16]對何首烏生品及不同炮制方法制備的炮制品進行急性毒性研究，發現小鼠灌胃何首烏不同炮制品水提物后主要急性毒性癥狀有腹瀉、怠動、毛色不華，其對小鼠急性毒性強度依次為生品組＞黑豆煮組＞黑豆汁蒸6 h組＞隔水燉組＞清蒸組＞黑豆汁蒸18 h組。何首烏引起肝毒性的主要化合物可能為順式二苯乙烯苷和大黃素-8-Oβ-D-葡萄糖苷[17-18]；而何首烏經黑豆蒸制后，對肝細胞的毒性降低，且潛在可能毒性成分順式二苯乙烯苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷含量也降低[19]。SD大鼠灌胃大黃素（12 mg/kg）60 d反復給藥未見明確的肝毒性，肝臟未見腫大，肝臟指數未升高[20]，與本實驗制何首烏提取物反復灌胃給藥結果一致。

本次實驗中發現，在給藥結束時麒麟丸低劑量組雄鼠A/G較對照組低16.7%；麒麟丸中、高劑量組雄鼠TBIL水平較對照組均升高22.2%；這兩項指標的變化均無劑量效應關系，且制何首烏提取物組雄鼠這兩項指標基本與對照組一致，判斷這兩項指標變化無毒理學意義。本次研究中麒麟丸低、中、高劑量組及制何首烏提取物組的給藥量分別相當于臨床成人每日最大劑量的6.7、13.3、26.7倍，SD大鼠灌胃麒麟丸（2 000～8 000 mg/kg）以及制何首烏提取物（354 mg/kg）90 d反復給藥對大鼠無明顯肝臟毒性。麒麟丸臨床劑量安全范圍較大，為麒麟丸的臨床應用提供了安全性實驗依據。