HPLC波長切換法同時測定養心寧神丸中7種成分的含量*

王 超，付 鵬，鄭 正

（北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700）

失眠困擾和威脅著人們的健康，嚴重影響了人們的正常生活。養心寧神丸由黨參、炒酸棗仁、炒茯苓、丹參、遠志等12味中藥組方而成，具有養心益脾、鎮靜安神的作用，臨床上主要應用于神經衰弱、心悸失眠、耳鳴目眩等疾病的治療[1]。現行質量標準僅對其進行了鑒別和理化檢查，未對任何成分進行定量檢測，目前也僅檢索到對該制劑中丹參所含兩種成分進行了定量測定的文獻報道[2]，由于養心寧神丸組方復雜，所含藥味較多，單味藥材所含1~2種成分的定量控制不能全面評價產品質量。方中重用黨參補氣健脾，龍眼肉補益心脾，養血安神，為君藥；酸棗仁養心生津，寧心安神，蓮子補脾滋元，養心安神，白術健脾益氣，燥濕利水，山藥補脾養胃，生津益肺，大棗補中益氣，合為臣藥；茯苓健脾和胃，寧心安神，丹參活血化瘀，清心除煩，涼血消癰，陳皮理氣健脾，補而不滯，遠志安神益智，石菖蒲開竅豁痰，醒神益智，化濕開胃，共為佐使藥。為更好地評價養心寧神丸的產品質量，本研究按照中藥質量標志物確認原則，選取處方中君藥黨參，臣藥炒酸棗仁，佐藥炒茯苓為研究對象，采用HPLC波長切換法對養心寧神丸中黨參所含主要活性成分黨參炔苷、丁香苷，炒酸棗仁所含代表性成分酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B，以及炒茯苓所含主要活性成分去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸成分含量進行同時測定，為全面評價養心寧神丸質量和提升養心寧神丸質量標準提供了科學的實驗數據。

1 材 料

1.1 藥物 養心寧神丸（規格：每丸重9g；批號：EH2401，EH2407，EH2411，廣州白云山陳李濟藥廠有限公司）；陰性樣品制備所用黨參、丹參、炒酸棗仁、炒茯苓、制遠志、大棗、炒山藥、炒白術、石菖蒲、陳皮、炒蓮子和龍眼肉藥材均購于北京同仁堂安徽中藥材公司，均符合《中華人民共和國藥典》2015年版一部規定。

1.2 試劑 丁香苷對照品（批號：111574-201605，含量：95.2%）、酸棗仁皂苷A對照品（批號：110734-201914，含量：96.0%）、酸棗仁皂苷B對照品（批號：110814-201809，含量：96.2%）（中國食品藥品檢定研究院）；黨參炔苷對照品（批號：PRF8092221，含量：99.0%）、氫土莫酸對照品（批號：PRF9042427，含量：90.2%）（成都普瑞法科技開發有限公司）；去氫茯苓酸對照品（批號：PS010107，含量：91.2%）、茯苓酸對照品（批號：PS010073，含量：99.7%）（成都普思生物科技股份有限公司）；所用試劑均為色譜純，水為純凈水。

1.3 主要儀器Shimadzu LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Phenomenex C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；XS105型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備 取黨參炔苷、丁香苷、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸對照品各適量，精密稱定，用甲醇溶解并制成質量濃度為0.812、0.254、0.338、0.192、0.146、0.118和0.352 mg/mL的混合對照品貯備液；精密吸取混合對照品貯備液2.5 mL，至50 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得黨參炔苷、丁香苷、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸質量濃度分別為40.6、12.7、16.9、9.6、7.3、5.9和17.86μg/mL的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取養心寧神丸適量，剪碎，取約3.0 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理45 min，放冷后用甲醇定容至刻度，過濾制得養心寧神丸供試品溶液。

2.3 陰性樣品溶液的制備 按養心寧神丸質量標準中的工藝處方，分別制備不含黨參、不含炒酸棗仁、不含炒茯苓的陰性樣品，再按上述方法制成陰性樣品溶液。

2.4 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱溫：30℃；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～9.0 min，14.0%A；9.0～17.0 min，14.0%A→31.0%A；17.0～26.0 min，31.0%A→59.0%A；26.0～42.0 min，59.0%A→92.0%A；42.0～50.0 min，92.0%A→14.0%A），流速：1.0 mL/min；檢測波長：266 nm（0～17.0 min，檢測黨參炔苷和丁香苷）[3-5]、210 nm（17.0～50.0 min，檢測酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸）[6-9]；進樣量：10μL。

2.5 專屬性試驗 精密吸取“2.1”“2.2”“2.3”項下各溶液依法進樣檢測，結果主成分黨參炔苷、丁香苷、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸色譜峰峰形良好，主成分峰與相鄰色譜峰均能完全分離，且分離度均＞1.5，陰性樣品對養心寧神丸中7種目標成分的測定無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 HPLC圖

2.6線性關系考察 分別精密吸取“2.1”項下混合對照品貯備液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置20 mL量瓶中，分別用甲醇制成系列混合對照品溶液，依法進樣檢測，記錄黨參炔苷、丁香苷、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸的峰面積，以峰面積對質量濃度進行線性回歸，結果見表1。

表1 線性關系考察結果

2.7 精密度試驗 取“2.1”項下混合對照品溶液重復進樣6次，記錄黨參炔苷、丁香苷、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸色譜峰峰面積，再計算相應色譜峰峰面積的RSD分別為0.55%、0.72%、0.69%、0.87%、0.96%、1.01%和0.78%。

2.8 穩定性試驗 取養心寧神丸同一份供試品溶液（批號：EH2401），于制備后0、2、4、7、12、18、24 h進樣檢測黨參炔苷、丁香苷、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸的峰面積，再計算相應峰面積的RSD分別為0.59%、0.68%、0.66%、0.90%、1.01%、0.98%和0.75%，結果表明養心寧神丸溶液在24 h內穩定。

2.9 重復性試驗 取同一批號養心寧神丸樣品（批號：EH2401），按“2.2”項下方法制備供試品溶液6份，依法進樣測定黨參炔苷、丁香苷、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸的峰面積，再計算相應含量的RSD分別為1.30%、1.64%、1.75%、1.89%、1.71%、1.83%和1.58%。

2.10 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批養心寧神丸（批號：EH2401），剪碎，分成9份，每份約1.5 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，按《中華人民共和國藥典》2015年版四部要求，分別按已知含有量的50%、100%和150% 3個水平精密加入混合對照品溶液（黨參炔苷、丁香苷、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸的質量濃度分別為0.281、0.087、0.115、0.074、0.057、0.043、0.128 mg/mL）1.0、2.0和3.0 mL各3份，再按“2.2”項下方法制備樣品溶液。在上述色譜條件下進行檢測，結果所測成分黨參炔苷、丁香苷、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸的平均加樣回收率（RSD）分別為99.58%（0.68%）、98.80%（1.51%）、97.98%（0.96%）、98.15%（1.48%）、96.69%（1.13%）、97.92%（1.34%）和100.07%（0.71%）。

2.11 樣品含量測定 取養心寧神丸樣品3批，按“2.2”項方法制備樣品溶液（每批制備3份樣品溶液），在上述色譜條件下進樣檢測，采用外標法計算黨參炔苷、丁香苷、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸的含量。檢測結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（mg/g，n=3）

3 討 論

3.1 供試品溶液制備方法的確定 本實驗在確定供試品溶液制備方法時，首先選用甲醇[3-7,10-15]、乙醇[8-9]處理樣品，采用超聲處理[3-8,13-16]和加熱回流[9]提取兩種提取方式，以養心寧神丸中黨參炔苷、丁香苷、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸的提取效果為首選指標，同時兼顧雜質峰影響等因素，結果超聲和加熱回流提取效果差異不明顯，由于加熱回流操作復雜，超聲提取相對簡單易控制，故采用超聲提取，而乙醇作為溶劑提取時去氫土莫酸和去氫茯苓酸提取率較低，故選用甲醇超聲處理供試品。在用甲醇超聲處理供試品時，對超聲時間（15、30、45、60 min）進行了考察，結果發現超聲45 min和60 min時的提取效率基本一致，為節省檢測時間，同時節能降耗，最終確定供試品溶液制備方法為甲醇超聲提取45 min。

3.2 流動相的選擇 本實驗在選擇流動相時，首先選用最基礎的甲醇-水和乙腈-水[3,5,9-11]流動相系統進行考察，結果發現甲醇-水流動相體系檢測時，基線漂移嚴重，同時檢測時間過長；乙腈-水流動相體系檢測基線平穩，檢測用時理想，不足之處是黨參炔苷和茯苓酸含量較高，色譜峰出現拖尾現象，造成與相鄰色譜峰不能完全分離，干擾檢測結果；考慮加入酸類調節。經過分析，最終確定采用乙腈-0.05%磷酸[6-8,12-14]為流動相進行梯度洗脫，同時測定養心寧神丸中黨參炔苷、丁香苷、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸，基線平穩，主成分色譜峰峰形對稱，與相鄰色譜峰均能達到有效分離。

本實驗采用HPLC波長切換法對養心寧神丸中7種成分黨參炔苷、丁香苷、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸含量進行了同時測定，對所建立的方法進行了方法學驗證，建立了養心寧神丸多指標成分質量控制模式，該方法可以為養心寧神丸質量標準提升和全面評價其產品質量提供參考依據。