補腎活血方凍干粉對低氧誘導HTR-8/SVneo滋養細胞HIF-1α及VEGFA表達的影響*

張 婕，倪 爽，李 佶

（上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032）

復發性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指連續發生兩次或兩次以上的自然流產，近年有逐漸上升趨勢，發生率為1%~5%，是婦產科中較難處理的疾病，直接影響患者的生殖健康[1]。RSA的發病原因復雜，與偶發性流產基本一致，但各種原因所占的比例有所不同，包括染色體異常、解剖結構因素、感染因素、內分泌因素、免疫因素、血栓前狀態等其他因素，其確切機制尚不明確[2]。RSA屬中醫學“滑胎”“屢孕屢墮”或“數墮胎”范疇，具有反復發作、胚胎應期而墮的特點。滑胎多為虛證，但可兼夾瘀、熱，辨證著重于臟腑、氣血之辨。李佶經過長期臨床實踐，從“腎”“瘀”論治，病證結合，中西貫通，自擬補腎活血方治療RSA，臨床收效頗佳[3]。在妊娠早期，胎盤絨毛外滋養層細胞（extravillous trophoblast，EVT）向子宮蛻膜層和肌層血管侵入和分化，重塑螺旋動脈，建立母—胎循環。RSA多發生在妊娠早期，人類早期的胚胎發育處在一個相對低氧的微環境中，維持正常情況下妊娠早期胎盤中這種生理性低氧環境對調節滋養層功能和胎盤早期發育至關重要[4]。缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是缺氧誘導因子家族中受到氧濃度調節的主要因子，血管生成是影響胎兒和胎盤發育的重要因素，依賴于多種生長因子（包括血管內皮生長因子及其受體）和多種信號傳導途徑[5]。本實驗基于臨床療效及前期研究基礎，通過使用化學低氧誘導劑氯化鈷（CoCl2）建立滋養細胞低氧模型，探索補腎活血方凍干粉對HTR-8/SVneo滋養細胞小管形成、HIF-1α和血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）表達的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 人絨毛膜滋養層細胞株HTR-8/SVneo由上海交通大學附屬國際和平婦幼保健院惠贈。

1.2 藥物與試劑 補腎活血方藥物組成：菟絲子15 g，杜仲15 g，續斷15 g，桑寄生15 g，當歸6 g，川芎9 g等，所有藥材由上海中醫藥大學附屬龍華醫院提供。將中藥復方放入煎藥壺中，加入1 000 mL的純凈水，浸泡后加熱煎藥，共煎2次后將水煎液混合，4層紗布過濾后旋轉蒸發儀濃縮；后將藥液倒于器皿中放置于冷凍干燥機的物料托盤中，-50℃預凍5 h，再抽真空干燥；干燥機升溫，最后固定到-40℃凍干72 h，制成含生藥量145 g/L的凍干粉，-20℃冰箱保存備用。補腎活血方凍干粉溶液母液用一級純水配制，濃度為0.1 g/mL，以0.22μm微孔濾膜過濾除菌。臨用時以含10%胎牛血清的培養基稀釋成所需濃度。

DMEM/F12培養基（批號：11320033）、胎牛血清（批號：1997802C）、胰酶（批號：25200072）（美國Gibco公司）；氯化鈷（Sigma公司，批號：1002965958）；二甲基亞砜（北京鼎國昌盛生物技術公司，批號：DH105-10）；一抗HIF-1α（批號：ab1）、VEGFA（批號：ab52917）（Abcam公司）；GAPDH（CST公司，批號：14C10）；二抗Anti-rabbit IgG（批號：A0208）、Anti-mouse IgG（批號：A0216）、Beyo ECL Plus（批號：P0018S）（碧云天生物技術有限公司）；Matrigel基質膠（美國Corning公司，批號：356234）；逆轉錄試劑盒（批號：RR037A）、Real-time PCR試劑盒（批號：RR420A）（TaKaRa公司）。PCR引物序列由上海生工生物有限公司設計合成。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.3 主要儀器BSA124S型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；Ti-E型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；YZB/USA1802-2009型恒溫培養箱（美國Thermo公司）；5424R型低溫臺式離心機（德國Eppendorf公司）；Synergy H1MF型酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；Cemiscope6300型凝膠成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司）；XSP-3C型顯微鏡（上海民怡儀器儀表有限公司）；MINI Protein V3型電泳儀、Mini Trans Blot型轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；ProFlex PCR型基因擴增儀（美國Life teconology）；ABI7500型實時熒光定量PCR儀（美國Life teconology）。

1.4 細胞培養 將HTR-8/SVneo滋養細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中，在含有5%CO2的37℃恒溫培養箱中培養，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，每2 d傳代1次，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.5 細胞分組與干預HTR-8/SVneo細胞隨機分為空白組、低氧模型組、補腎活血方凍干粉低劑量組、補腎活血方凍干粉中劑量組、補腎活血方凍干粉高劑量組。根據前期MTT實驗結果篩選補腎活血方安全有效劑量即補腎活血方凍干粉終濃度5、10、25 mg/L。除空白組外，其余各組均給予CoCl2（100μmol/L）誘導低氧造模[6]，中藥組分別再同時給予不同濃度的補腎活血方凍干粉溶液。細胞培養48 h后收集用于后續實驗。

1.6 檢測指標

1.6.1 Tube formation法檢測血管生成 將細胞外基質膠Matrigel充分溶解，用基礎培養基1∶2稀釋后以150μL/孔鋪于24孔板中，置于37℃、5% CO2細胞培養箱中孵育2 h使其凝固成膠。分別收集空白組、低氧模型組和補腎活血方凍干粉低、中、高劑量組的細胞，1 500 r/min離心5 min，用含1%FBS的培養基調整細胞濃度為2×105個/mL。向鋪好膠的24孔板中每孔加入上述細胞懸液500μL，37℃、5% CO2細胞培養箱中孵育8 h，每組設3個復孔。倒置顯微鏡下觀察各組小管形成情況并拍照，100倍下每組隨機選取5個視野，計數形成小管的分支點數，取平均值進行統計分析。

1.6.2 Real time-PCR檢測HTR-8/SVneo細胞HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA的表達 按“1.5”項下進行細胞分組與干預。細胞培養48 h后，采用Trizol試劑提取各組細胞總RNA并測定其濃度，按照試劑盒說明書合成cDNA，進行Real time PCR，應用2－ΔΔCt對基因進行相對定量計算。反應條件：95℃1 min預變性；95℃5 s變性，58℃15 s退火，72℃30 s延伸，共40個循環。

1.6.3 Western Blotting檢 測HTR-8/SVneo細 胞HIF-1α、VEGFA蛋白的表達 按“1.5”項下進行細胞分組與干預。細胞培養48 h后分別加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，離心提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，各組等量上樣，10%SDSPAGE電泳，350 mA轉膜60 min，5%的BSA室溫封閉1 h，孵育HIF-1α、VEGFA（稀釋倍數1∶200）和GAPDH（稀釋倍數1∶400）一抗工作液4℃過夜，TBST洗膜8 min×5次，室溫搖動孵育二抗工作液1 h，TBST洗膜8 min×5次，ECL發光顯影，用Image J分析軟件對條帶進行定位和分析。

1.7 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組細胞血管形成能力比較 與空白組比較，低氧模型組、補腎活血方凍干粉各劑量組小管形成能力明顯升高（P＜0.05）；與低氧模型組比較，補腎活血方凍干粉低、中、高劑量組小管形成能力升高（P＜0.05）；補腎活血方凍干粉高劑量組小管形成能力高于補腎活血方凍干粉中、低劑量組（P＜0.05），補腎活血方凍干粉低劑量組小管形成能力與補腎活血方凍干粉中劑量組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖1、表2）

圖1 各組細胞小管形成能力

表2 各組細胞小管形成能力比較（±s）

表2 各組細胞小管形成能力比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與低氧模型組比較，bP＜0.05；與補腎活血方凍干粉低劑量組比較，cP＜0.05；與補腎活血方凍干粉中劑量組比較，dP＜0.05

組別 n 給藥劑量(mg/L)小管分支點數空白組 3 - 12.35±1.25低氧模型組 3 - 27.76±1.79a補腎活血方凍干粉低劑量組 3 5 31.61±0.82a b補腎活血方凍干粉中劑量組 3 10 33.24±1.22a b補腎活血方凍干粉高劑量組 3 25 38.84±1.68a b c d

2.2 各組細胞HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA表達情況 與空白組比較，補腎活血方凍干粉高劑量組HIF-1αmRNA的相對表達量升高（P＜0.05），低氧模型組和補腎活血方凍干粉低、中、高劑量組VEGFA mRNA的相對表達量升高（P＜0.05）；與低氧模型組比較，補腎活血方凍干粉高劑量組HIF-1αmRNA的相對表達量升高（P＜0.05），補腎活血方凍干粉中、高劑量組VEGFA mRNA的相對表達量升高（P＜0.05），其余各組差異無統計學意義（P＞0.05）。與補腎活血方凍干粉低劑量組比較，補腎活血方凍干粉高劑量組HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA的相對表達量升高（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組細胞HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA表達比較（±s）

表3 各組細胞HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA表達比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與低氧模型組比較，bP＜0.05；與補腎活血方凍干粉低劑量組比較，cP＜0.05

組別 n給藥劑量（mg/L）HIF-1αmRNA VEGFA mRNA空白組 3 - 1.01±0.18 1.03±0.28低氧模型組 3 - 1.11±0.12 1.93±0.13a補腎活血方凍干粉低劑量組3 5 1.20±0.14 2.43±0.24a補腎活血方凍干粉中劑量組3 10 1.22±0.10 2.79±0.29ab補腎活血方凍干粉高劑量組3 25 1.50±0.15abc 3.01±0.47abc

2.3 各組細胞HIF-1α、VEGFA蛋白表達情況 與空白組比較，低氧模型組及補腎活血方凍干粉低、中、高劑量組HIF-1α、VEGFA蛋白的相對表達量均升高（P<0.05）；與低氧模型組比較，補腎活血方凍干粉低、中、高劑量組HIF-1α、VEGFA蛋白的相對表達量均升高（P<0.05）。與補腎活血方凍干粉低劑量組比較，補腎活血方凍干粉高劑量組HIF-1α、VEGFA蛋白的相對表達量升高（P<0.05）；與補腎活血方凍干粉中劑量組比較，補腎活血方凍干粉高劑量組HIF-1α蛋白的相對表達量升高（P<0.05），而VEGFA蛋白相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）。（見圖2、表4）

圖2 各組細胞HIF-1α、VEGFA蛋白表達情況

表4 各組細胞HIF-1α、VEGFA蛋白的相對表達量比較（±s）

表4 各組細胞HIF-1α、VEGFA蛋白的相對表達量比較（±s）

注：與空白組比較，aP<0.05；與低氧模型組比較，bP<0.05；與補腎活血方凍干粉低劑量組，cP<0.05；與補腎活血方凍干粉中劑量組比較，dP<0.05

組別 n給藥劑量（mg/L）VEGFA HIF-1α空白組 3 - 0.25±0.05 0.03±0.01低氧模型組 3 - 0.51±0.01a 0.20±0.07a補腎活血方凍干粉低劑量組3 5 0.70±0.11ab 0.43±0.08ab補腎活血方凍干粉中劑量組3 10 0.81±0.09ab 0.40±0.09ab補腎活血方凍干粉高劑量組3 25 0.84±0.12abc 0.66±0.07abcd

3 討 論

復發性流產的不良生育現狀是育齡期及高齡產婦所面臨的嚴峻問題，由于其難治性，給患者及家庭造成極大的身體和精神痛苦。中醫學對RSA的診治有著豐富的理論及實踐經驗。隋代巢元方在《諸病源候論·婦人妊娠病諸候上》中首先提出了：“妊娠數墮胎候”[7]。古代多數醫家將數墮胎、滑胎的病因歸結為腎虛、氣血虛弱及血瘀。《素問·奇病論篇》中提到包絡系于腎，認為胚胎發育與腎臟關系密切。腎為先天之本，主藏精、主生殖，胞胎所養，胚胎的著床發育均依靠先天腎精的滋養和腎氣的固護[8]。清代張錫純《醫學衷中參西錄》創制的壽胎丸防治滑胎流傳至今[9]。王清任在《醫林改錯》中提出滑胎與血瘀相關的觀點：“不知子宮內，先有瘀血占其地，胎至三月再長，其內無容身之地，胎病靠擠血不能入胎胞，從傍流而下，故先見血。血既不入胎胞，胎無血養，故小產。”其創立的“少腹逐瘀湯”成為治療血瘀型滑胎的代表方劑[10]。活血類藥物雖屬妊娠禁忌藥，但是遵循《素問·六元正紀大論篇》“有故無殞，亦無隕，衰其大半而止”的治療原則，醫者不拘于成見，可取得良好療效[11]。根據復發性流產“腎虛血瘀”的病機特點，李佶提出的補腎活血方具有補腎活血安胎之效，在治療復發性流產的12周妊娠通過率及妊娠結局療效滿意[3]，但現代藥理機制尚不明確。

胚胎生長發育的細胞生物學過程極其精細而復雜。在妊娠早期，胚胎和胎盤發育都在特定的氧濃度下進行，氧被認為是滋養細胞增殖和分化的主要調節因素，胎盤發育是在相對缺氧的環境中發生。1996年GENBACEV O等[12]首先提出低濃度氧可提升人早孕期滋養細胞的增殖，而大氣中氧濃度（21% O2，海平面水平）則刺激分化。妊娠10周前，EVT在螺旋動脈內形成“滋養細胞栓”，成功地防止母體血液進入絨毛間隙，從而創建了早期妊娠生理性低氧環境（2%~3% O2）[13]。早孕期，滋養細胞在低氧條件下增殖，孕12周以后，胎盤絨毛經歷著缺血再灌注，隨之滋養細胞周圍氧濃度逐漸增加（8% O2），在高氧條件下分化成具有侵襲表型的滋養細胞，逐步浸潤到子宮膜、子宮肌層的淺1/3及相關的螺旋小動脈，確保廣泛的螺旋動脈重鑄[14]。

機體通過調節一系列基因表達的變化來適應慢性低氧環境，其中缺氧誘導因子1（HIF-1）受缺氧的誘導，在低氧狀態的調控中發揮轉錄調控作用。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β構成的2個亞基的異源二聚體，其中HIF-1α亞基表達受低氧誘導，HIF-1β亞基屬構建型表達，不受低氧的調節和影響。人類胎盤在氧合方面提供了一個獨特的環境，經歷了一個從缺氧環境到更高氧合環境的過渡，這種氧張力和動態HIF-α信號的生理開關是胎盤發育所必需的[15]。在缺氧情況下，HIF-1α的泛素-蛋白酶體降解途徑被阻斷導致其在細胞內蓄積，從而啟動下游因子的轉錄與翻譯。HIF-1α在妊娠早期調節滋養細胞對缺氧條件的適應，穩定的HIF-1α轉運到細胞核，與血管生成調節的靶基因缺氧反應元件結合，誘導胚胎新生血管生成，增加血管通透性，減輕組織缺氧情況[16]。血管表皮生長因子（VEGF）屬于一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，是受HIF-1α調控的下游因子之一，HIF-1α與VEGF的缺氧反應元件結合后啟動其轉錄與翻譯，使其相關產物表達增加，VEGF在低氧條件下表達也被上調[17]。VEGFA是VEGF生長因子家族的重要成員之一，具有促進血管通透性增加、細胞外基質變性、血管內皮細胞遷移及血管形成等作用。研究證實VEGF的表達減弱與早孕丟失有關[18]。ZHU L J等[19]通過對稽留流產患者及健康早孕女性孕7~10周的絨毛組織進行比較，顯示稽留流產患者絨毛組織中活性氧簇（ROS）水平明顯增高，而HIF-1α濃度明顯降低。這提示高氧狀態可引起HIF-1α低表達，滋養細胞增殖力下降，血管生成障礙導致SPA重鑄不足。NüSKEN E等[20]報道了缺氧條件下（0.1%、1%、3% O2）培養正常足月胎盤原代滋養層細胞中HIF-1α蛋白和HIF-1α mRNA表達的增加。WANG K等[21]在低氧處理的人滋養層細胞系HTR-8/SVneo中也取得了同樣的結果。研究顯示活血化瘀中藥可以增加血管內皮細胞對VEGF的敏感性，進而促進血管出芽、生長，形成新的血管新枝，促進血管的生成與重建[22]。郝樂樂等[23]研究證實補腎安胎沖劑能改善復發性流產小鼠母胎界面血管生成，提高血清和蛻膜組織中HIF-1α蛋白水平和HIF-1αmRNA表達水平，因此，HIF-1α適度表達與維持正常妊娠的表達相關。

CoCl2是比較常用的低氧模型誘導劑，本實驗通過模擬低氧環境發現了HIF-1α/VEGFA信號通路在胚胎發育過程中的調節作用。研究結果顯示低氧環境可以促進絨毛血管生成，在補腎活血方凍干粉的作用下可以使體外培養的HTR-8/SVneo滋養細胞小管形成進一步增加，同時提高滋養細胞HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA和蛋白的表達。妊娠早期HIF-1αmRNA活性的上調提高了組織細胞在缺血缺氧情況下的存活能力，增加組織在缺氧環境中的血管生成；但組織若長期處于缺氧環境下HIF-1α的表達可能降低。此外，隨著妊娠進程胚胎發育氧含量向正常轉變，為了防止胚胎受到再灌注過程中氧自由基的損害，HIF-1α可以改善胚胎組織細胞低氧環境下的能量代謝[24]。因此，補腎活血方對RSA作用機理還有待進行更加深入的探討。綜上所述，本研究探討了絨毛血管生成與HIF-1α/VEGFA信號通路之間的關系及補腎活血方的調控作用，為臨床應用補腎活血方治療RSA提供了一定的理論依據。