注射用丹參多酚酸鹽對動脈粥樣硬化大鼠的作用和機制探討*

陳 麗，蔡惠鈴，李影雄，孟泳錚，李敏霞

（1.佛山市中醫院，廣東 佛山 528000；2.廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東 廣州 510102）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種全身性慢性疾病，是冠心病、缺血性腦卒中等多種心腦血管疾病最重要的病理基礎，最終致死率和致殘率非常高[1]。流行病學調查顯示，冠心病、腦卒中等動脈粥樣硬化性疾病是我國居民致死的首要原因，嚴重威脅我國居民的健康，降低生活質量[2]。而且隨著生活方式的改變和老齡人口的劇增，AS的發病率明顯上升并且趨于年輕化。脂質代謝紊亂、炎癥反應、氧化損傷、細胞外基質降解等均是導致AS發生發展的核心機制[3]。AS屬于中醫學“胸痹”“脈痹”“中風”等范疇，其核心病機為瘀血痹阻。注射用丹參多酚酸鹽由丹參提取而成，具有活血、化瘀、通脈等功效，本課題組臨床研究發現注射用丹參多酚酸鹽可以降低冠心病、腦卒中患者頸動脈斑塊厚度，縮小斑塊面積，但其機制仍未闡明。因此，本實驗復制了AS大鼠模型，并給予注射用丹參多酚酸鹽干預，觀察其對AS大鼠斑塊、血脂、炎癥、氧化損傷、細胞外基質等的影響，初步探討其防治AS的作用和可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6周齡SPF級雄性SD大鼠43只，體質量（200±10）g，購自廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（粵）2019-0035；飼養環境為溫度（22±2）℃，濕度50%~60%，12 h明暗交替。實驗過程中采用過量麻醉法處死。高脂飼料配方：基礎飼料81.3%、豬油10%、蔗糖5%、丙基硫氧嘧啶0.2%、膽酸鈉0.5%、膽固醇3%；基礎飼料和高脂飼料委托廣東省醫學實驗動物中心進行加工。本實驗通過佛山市中醫院醫學實驗動物倫理委員會的批準。

1.2 藥物與試劑 注射用丹參多酚酸鹽（上海綠谷制藥有限公司，批號：20190113，規格：100 mg/瓶）；阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司，批號：20181215，規格：10 mg/片）；血脂試劑盒[總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒（貨號：HL20142）、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒（貨號：HL20195）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒（貨號：HL20197）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒（貨號：HL20196）、氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）試劑盒（貨號：HL10046）]（上海哈靈生物科技有限公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（貨號：ER1393）、白介素-1β（IL-1β）試劑盒（貨號：ER1094）、白介素-6（IL-6）試劑盒（貨號：ER1105）、白介素-10（IL-10）試劑盒（貨號：ER0033）（武漢菲恩生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（貨號：GD-AW1922）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（貨號：GD-JG0454-E）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（貨號：GD-S1921-A）、單核細胞趨化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）試劑盒（貨號：GD-DS1710）、血管細胞黏附分子-1（Vascular Cell Adhesion Molecule-1，VCAM-1）試劑盒（貨號：GD-DX1591）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）試劑盒（上海古朵生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器TGL-15M臺式微量高速冷凍離心機（湖南平凡科技有限公司）；AU5800全自動生化分析儀（貝克曼庫爾特商貿中國有限公司）；HBS-1096C酶標分析儀（南京德鐵實驗設備有限公司）；Tissuelyser-24冷凍液氮低溫研磨儀（上海凈信實業發展有限公司）。

1.4 造模與分組43只大鼠進行適應性喂養7 d，隨機取10只作為對照組。其余33只大鼠參照文獻[4]建立AS大鼠模型，造模第1天一次性腹腔注射維生素D3 60萬U/kg，并且給予高脂飼料喂養（20 g/d）；對照組大鼠一次性腹腔注射等體積的生理鹽水，并且給予基礎飼料喂養（20 g/d），造模時間為8周。AS模型成功的標準[5]：主動脈見斑塊形成。8周后，27只大鼠造模成功，造模成功率為81.82%（27/33）。隨后將成模27只大鼠隨機分為模型組、丹參多酚酸鹽組和阿托伐他汀組，每組9只。

1.5 實驗給藥 按照“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”，丹參多酚酸鹽組大鼠予以注射用丹參多酚酸鹽腹腔注射，20 mg/（kg·d）；阿托伐他汀組大鼠灌胃給予阿托伐他汀鈣片溶液，2 mg/（kg·d），對照組和模型組大鼠予以等體積的生理鹽水腹腔注射，連續給藥4周。4周后處死大鼠，取材并進行相關指標檢測。

1.6 觀察指標

1.6.1 血清指標 腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，剖開腹腔，腹主動脈取血，離心后取血清，采用全自動生化檢測儀檢測大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C，ELISA法檢測血清ox-LDL、TNF-α、IL-1β、IL-6含量，光度法測定血清SOD、GSH-Px、MDA含量。

1.6.2 主動脈病理變化 處死大鼠，取主動脈，生理鹽水沖洗后4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色。光鏡下觀察主動脈病理變化。

1.6.3 主動脈MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量 取適量大鼠主動脈組織，PBS反復清洗去除血液，稱重，將主動脈和PBS加入勻漿器后充分研磨，再利用超聲破碎。勻漿液經5 000 g離心5 min后取上清液，采用ELISA法檢測MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量。

1.7 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行統計處理，計量資料用“均數±標準差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法檢驗，以P<0.05為差異有統計意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠主動脈病理變化 對照組大鼠主動脈內膜、中膜、外膜均未見增生、肥厚；模型組大鼠主動脈中膜平滑肌細胞明顯增生，血管壁明顯增厚，大量泡沫細胞聚集，形成一動脈粥樣硬化斑塊；丹參多酚酸鹽組和阿托伐他汀組大鼠主動脈中膜輕微增生，無動脈粥樣硬化斑塊形成。（見圖1）

圖1 各組大鼠主動脈病理變化（HE，×200，標尺=100μm）

2.2 各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、ox-LDL含量比較 與對照組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL含量明顯升高（P<0.05），HDL-C含量明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，丹參多酚酸鹽組和阿托伐他汀組大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL含量明顯降低（P<0.05），HDL-C含量明顯升高（P<0.05）。（見圖2）

圖2 各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、ox-LDL含量比較（±s，n=9）

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量比較 與對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯升高（P<0.05），IL-10含量明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，丹參多酚酸鹽組和阿托伐他汀組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯降低（P<0.05），IL-10含量明顯升高（P<0.05）。（見圖3）

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

圖3各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量比較（±s，n=9）

2.4 各組大鼠血清SOD、GSH-Px、MDA含量比較 與對照組比較，模型組大鼠血清MDA含量明顯升高（P<0.05），SOD、GSH-Px含量明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，丹參多酚酸鹽組和阿托伐他汀組大鼠血清MDA含量明顯降低（P<0.05），SOD、GSH-Px含量明顯升高（P<0.05）。（見圖4）

圖4 各組大鼠SOD、GSH-Px、MDA含量比較（±s，n=9）

2.5 各組大鼠主動脈MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量比較 與對照組比較，模型組大鼠主動脈MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，丹參多酚酸鹽組和阿托伐他汀組大鼠主動脈MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量明顯降低（P<0.05）。（見圖5）

圖5 各組大鼠主動脈MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量比較（±s，n=9）

3 討 論

中醫學無AS之病名，根據其臨床表現，可歸屬于中醫學“胸痹”“脈痹”“中風”等范疇，中醫學認為其核心病機為瘀血痹阻，氣為血之帥，血為氣之母，氣血失和，或氣虛而滯，或氣郁而滯，均可引起血流不暢，瘀血內生，痹阻血脈，化生斑塊[6-8]。痰濁、寒凝、水濕等均可以導致血運不暢，滯而成瘀，痹阻血脈，化生斑塊。因此，治療上應以活血化瘀為大法。注射用丹參多酚酸鹽是由丹參經提取的多酚酸鹽化合物組成，丹參味苦，性微寒，歸心、肝經，具有活血化瘀、通絡止痛等功效。注射用丹參多酚酸鹽具有活血、祛瘀、通絡功效。現代藥理研究表明，注射用丹參多酚酸鹽具有抗氧化損傷、抑制炎癥等作用[9]。

動脈粥樣硬化機制尚未完全闡明，脂質代謝紊亂、炎癥反應、氧化損傷、細胞外基質降解等在動脈粥樣硬化的發生發展中均起到重要的作用。脂質代謝紊亂是導致AS的最重要病理基礎，血液中TG、TC、LDL-C含量升高可以導致血管內皮損傷，引發血管內皮功能障礙，單核細胞通過破損的血管內皮進入內膜間隙，并吞噬ox-LDL形成泡沫細胞。泡沫細胞可以刺激生長因子釋放，進而促進血管平滑肌增殖，血管壁肥厚，形成脂質條紋并進展為動脈粥樣硬化斑塊[10-11]。HDL-C可以通過促進膽固醇運載至外周組織細胞，從而減少脂質沉積于血管內膜[12]。因此，調節脂質代謝是防治AS的關鍵。本研究結果發現，AS模型組大鼠主動脈斑塊形成，血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL含量明顯升高，HDL-C含量明顯降低；而丹參多酚酸鹽組大鼠主動脈無斑塊形成，血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL含量明顯降低，HDL-C含量明顯升高。因此，注射用丹參多酚酸鹽具有抑制和減緩動脈粥樣硬化斑塊形成的作用，可能是通過調節脂質代謝途徑實現。

有學者提出動脈粥樣硬化屬于一種慢性低度炎癥性反應。在AS形成過程中，平滑肌細胞、巨噬細胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子，導致機體處于一種慢性低度炎癥反應狀態。TNF-α可以增加血管內皮的通透性，從而促使LDL-C進入血管內皮細胞進而形成泡沫細胞[13-14]。而且TNF-α還可以刺激IL-1β、IL-6釋放，加重血管炎癥反應[15]。IL-1β可以通過促進黏附因子表達和內皮細胞增殖介導AS形成[16]。IL-6可以加強局部炎癥反應，促進黏附因子的表達，促進單核細胞和巨噬細胞遷移，促進血管內皮平滑肌細胞增殖，從而導致斑塊形成，并可以導致斑塊不穩定[17]。IL-10是一種強效抑炎因子，可以抑制炎癥因子的生成和釋放，抑制平滑肌細胞增殖，減緩動脈粥樣硬化。因此，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子的表達和促進IL-10的表達可以改善動脈粥樣硬化。氧自由基可以損傷血管內皮細胞，促進脂質和單核細胞進入血管內膜下，導致斑塊形成[18-19]。而機體內的抗氧化酶可以清除氧自由基，減輕氧化損傷。SOD、GSH-Px是機體內的主要抗氧化酶，可以清除氧自由基。MDA是機體內的氧化代謝產物，反映機體氧化損傷的嚴重程度。SOD、GSH-Px、MDA是反映機體氧化損傷的重要標志物。本研究結果發現，AS模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA含量明顯升高，IL-10、SOD、GSH-Px含量明顯降低；而丹參多酚酸鹽組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA含量明顯降低，IL-10、SOD、GSH-Px含量明顯升高。說明注射用丹參多酚酸鹽可以通過下調TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA的表達，上調IL-10、SOD、GSH-Px的表達，抑制炎癥反應和抗氧化損傷從而抑制和減緩AS的形成。

VCAM-1是一種由內皮細胞表達的糖蛋白，可以促進單核巨噬細胞、中性粒細胞等黏附在破損血管內壁，遷移至血管內膜后形成泡沫細胞，介導AS進展[20]。MCP-1可以趨化單核細胞和淋巴細胞遷移至血管內膜下，趨化炎性細胞聚集，介導斑塊形成。細胞外基質是血管壁的重要組成部分，其降解和重塑參與了AS的發生發展[21]。MMP-9可以降解細胞外基質，導致斑塊不穩定和斑塊形成。本研究結果發現，AS模型組大鼠主動脈MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量明顯升高；而丹參多酚酸鹽組大鼠主動脈MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量明顯降低。說明注射用丹參多酚酸鹽可以通過抑制MCP-1、VCAM-1、MMP-9的表達而抑制AS的形成。

綜上所述，注射用丹參多酚酸鹽可以通過調節脂代謝，抑制炎癥和抗氧化損傷改善動脈粥樣硬化。