中藥復方合劑抗甲型H1N1流感病毒活性的實驗研究

楊 敬，徐 勇，林傳友

（華中科技大學同濟醫學院基礎醫學院，湖北 武漢 430030）

1918—1919年西班牙爆發了人類歷史上最為嚴重的流感疫癥，造成約5億人感染，5千多萬人死亡，直到1933年，英國科學家Smith Andenwes才第一次從人身上分離出了該病毒，并命名為H1N1。時至今日，一百多年過去了，人類與病毒的搏斗從未停止，隨著醫學和科學技術的發展，人類對流感病毒有了更深的認知。甲型H1N1流感病毒屬正黏液病毒科，由于其RNA片段由8條獨立的RNA單鏈組成，所以表面抗原血凝素（HA）和神經酰胺酶（NA）極易發生變異，導致新的病毒株和亞型不斷形成，造成流感大流行乃至爆發[1-2]。西藥因其成分的單一性、不良反應和長期使用的耐藥性，限制了其臨床使用范圍，預防性接種疫苗效果也不夠理想[3]，而中藥來源豐富，作用范圍廣，毒副作用小，表現出獨特優勢。

中藥復方合劑由板藍根、黃芩、柴胡、知母、甘草、黃芪、金銀花、魚腥草等十二味中藥組成，具有清熱解毒、疏散風熱之功效，較之單方具有多組分、多途徑、多靶點的特點，因而具有更廣泛的應用前景。本實驗通過雞胚法觀察了中藥復方合劑3種給藥方式對甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）的抑制作用和對雞胚的保護作用，以期為臨床用藥和中藥開發提供實驗依據。

1 材 料

1.1 實驗動物9日齡SPF級健康雞胚193枚，質量（52±2）g，武漢中博生物股份有限公司提供，動物許可證號：SYXK（鄂）2016-0086，實驗符合醫學實驗動物管理委員會的要求。

1.2 藥物與試劑 中藥復方合劑：由板藍根、黃芩、柴胡、知母、甘草、黃芪、金銀花、魚腥草等十二味中藥組成，按傳統方法蒸餾水浸泡、煎煮、合并、濃縮至100 mL，每毫升相當于1 g生藥（1 g/mL），由佛山康力泰有限公司提供，高壓滅菌，4℃保存備用；利巴韋林注射液（山東魯抗辰欣藥業有限公司，國藥準字H20003176）；枸櫞酸鈉（上海試劑一廠，批號：2004-07-17）；生理鹽水（武漢福星生物藥業有限公司，國藥準字H42022223）；1%雞紅細胞懸液：采集健康公雞血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝，生理鹽水洗滌3遍后配制。

1.3 病毒株 甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）由武漢大學醫學院病毒所提供，在雞胚中傳代恢復活力。將保存的病毒液10-3～10-5倍稀釋后，接種于9日齡雞胚數枚，每胚0.2 mL，封孔后置35℃，每12 h照蛋觀察一次，棄去24 h內死亡胚，24～96 h未死雞胚放4℃過夜，收集尿囊液，測血凝滴度，選1∶640以上的病毒液，備用。

1.4 主要儀器SW-TFG-18型超凈工作臺（江蘇凈化設備廠）；PYX-DHS-40X50-BS-Ⅱ型隔水式電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）；TDZ5-WS型低速臺式離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）。

2 方 法

2.1 中藥復方合劑對雞胚毒性的測定 中藥復方合劑用無菌生理鹽水連續對倍稀釋成7個稀釋度，分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128，備用。常規選擇生長良好的9日齡SPF雞胚，檢卵燈下觀察并標記氣室與胚胎的位置，2.5%碘酒及75%酒精消毒，用無菌錐子在氣室旁無大血管處錐一個直徑2 mm小孔，再次消毒，1 mL注射器吸取待接種的藥物0.2 mL，注入尿囊腔，每個稀釋度作5枚雞胚，同步設生理鹽水對照，消毒后石蠟封口，置35℃孵化箱孵育96 h，連續觀察雞胚生長發育情況，棄去24 h內死胚，以雞胚可存活96 h的最大濃度作為藥物的最大無毒限量。

2.2 雞胚半數感染量EID50的測定 用無菌生理鹽水10倍稀釋A/PR/8/34（H1N1）病毒株，依次10-1～10-7各稀釋度病毒，每稀釋度接種5枚，0.2 mL/枚，石蠟封口，置35℃恒溫箱孵育，逐日照蛋觀察至96 h，棄去24 h內死亡雞胚，死亡雞胚放4℃冷卻或過夜，收獲的尿囊液作血球凝集試驗，出現血凝者判陽性，依據Reed-Muench法進行計算[4]。

EID50=高于50%的稀釋度的對數+距離比例×稀釋系數的對數

2.3 中藥復方合劑對甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的抑制作用

2.3.1 中藥復方合劑對雞胚的保護作用SPF級健康雞胚隨機分為正常對照組、病毒對照組、利巴韋林組和中藥復方合劑低、中、高劑量組，每組6枚。在藥物對雞胚安全濃度范圍內，采取3種給藥方式，（1）同時給藥（中藥和病毒液胚外混合后接種）：先將中藥復方合劑0.1 mL與100EID50H1N1病毒液0.1 mL充分混合后，置35℃恒溫箱孵育2 h，再接種于9日齡雞胚尿囊腔。（2）預防給藥（先接種中藥后接種病毒）：先將中藥復方合劑0.1 mL接種于9日齡雞胚尿囊腔，置35℃恒溫箱孵育2 h，再接種0.1 mL 100EID50的H1N1病毒液。（3）治療給藥（先接種病毒后接種中藥）：先將0.1 mL 100EID50的H1N1病毒液接種于9日齡雞胚尿囊腔，置35℃恒溫箱孵育2 h，再接種0.1 mL中藥復方合劑。每組接種完后，置35℃恒溫箱繼續孵育至96 h，記錄雞胚的存活率和測定尿囊液血凝效價，計算血凝滴度[5]。

2.3.2 尿囊液血凝效價的測定 收集96 h后的各組雞胚尿囊液，生理鹽水稀釋至1∶20～1∶64，于96孔V型板上，取稀釋好的尿囊液50μL/孔，再加入1%雞紅細胞50μL/孔，漩渦器上震蕩1 min，使雞紅細胞與病毒充分混合，置37℃30 min，待對照孔紅細胞沉淀，即可觀察結果，以“+”為終點，即能夠使50%紅細胞凝集的血凝素的最高稀釋度作為該血凝素效價。

2.4 統計學方法Reed-Muench法計算藥物對雞胚半數感染量（EID50），數據采用SPSS 25.0統計學軟件進行分析，計量資料以“均數±標準差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 中藥復方合劑對雞胚最大安全濃度 中藥復方合劑原液96 h接種后存活率為60%，1∶2倍比稀釋濃度96 h接種后無死亡雞胚，且數日后有健康雛雞孵出，說明500 mg/mL的濃度對雞胚無毒性，可作為最大安全濃度。（見表1）

表1 中藥復方合劑對雞胚的毒性作用

3.2 雞胚EID50值Reed-Muench法計算得雞胚EID50為10-3.83，故實驗采用100EID50病毒攻擊量。（見表2）

表2 甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）EID50的測定

3.3中藥復方合劑對甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的抑制作用 與正常對照組比較，病毒對照組雞胚均出現全身充血、出血，雞胚死亡率100%；在安全濃度范圍內，中藥復方合劑高、中、低劑量組對雞胚均有保護作用，其中3種給藥方式的中藥復方合劑高劑量組雞胚存活率為100%，與病毒對照組比較，差異有統計學意義（P<0.01）；同時給藥和預防給藥方式的中藥復方合劑中劑量組雞胚存活率為100%，高于治療給藥方式的中藥復方合劑中劑量組（83%），中藥復方合劑低劑量組對雞胚也有一定程度的保護作用，同時給藥、預防給藥和治療給藥雞胚存活率分別為83%、67%、67%，說明不同的給藥方式對雞胚的保護程度不同，同時給藥效果最好。在血凝滴度試驗中，如果藥物組血凝滴度低于病毒對照組的1/4，說明藥物對病毒增殖有抑制作用[6]，結果顯示，同時給藥方式的中藥復方合劑高、中劑量組，以及預防給藥和治療給藥方式的中藥復方合劑高劑量組血凝滴度均低于病毒對照組的1/4（P<0.01），具有明顯抑制流感病毒的作用，而且同時給藥強于預防給藥和治療給藥，預防給藥略強于治療給藥。（見表3~5）

表3 同時給藥方式對雞胚的保護作用

表4 預防給藥方式對雞胚的保護作用

表5 治療給藥方式對雞胚的保護作用

4 討 論

傳染性疾病在中醫學上屬“時疫”“溫病”的范疇[7]，在臨床實踐中，主要采取清熱、解毒的治療原則[8-9]。中藥復方合劑為傳統中藥材，以解表藥、清熱藥和補益藥為主藥，通過直接殺滅病毒、抑制病毒唾液酶活性、阻斷病毒吸附等途徑發揮抗病毒作用[10]。現代藥理學研究證明，板藍根、黃芩、柴胡、甘草、金銀花、魚腥草等具有明顯的抗流感病毒作用[11]，從這些中藥中提取分離得到抗流感病毒的活性成分包含黃酮、揮發油、有機酸、多糖、生物堿等不同類別。板藍根具有清熱解毒、涼血利咽之功效，成分中的生物堿、苯丙素、有機酸等能通過抑制病毒增殖，預防和阻斷病毒附著而發揮其抗流感活性，由醇提部位制取的總有機酸部位抗A/PR/8/34（H1N1）藥效最強[12]；黃芩中富含四十多種黃酮類物質，主要有效成分黃芩苷、黃芩素均有抗H1N1活性，機制包括直接抗病毒作用和調節免疫炎癥反應兩方面[13]；柴胡中多種柴胡皂苷對于Na+，K+-ATP酶有很強的抑制作用，能引起能量和水鹽代謝的變化，從而起到抗病毒作用[14]。此外，柴胡多糖有促進免疫的作用，可增加Kupffer細胞的吞噬功能和NK細胞的功能；甘草粗提物、甘草甜素均具有抗流感病毒作用，甘草多糖能增強小鼠機體免疫作用[15]；黃芪具有補氣升陽、調節免疫功能的作用，化學成分包括皂苷類、多糖、黃酮類等[10]；金銀花作為清熱解毒的代表藥，含以上多種成分，其水煎液能明顯降低甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）感染小鼠的肺指數，使小鼠肺部病變程度明顯減輕[16]。金銀花有抗炎、解熱、增強機體免疫功能的作用。因此，中藥復方合劑對H1N1的抑制作用并不是單純的抗病毒，而是多方面、多角度、多途徑發揮作用，體現出中醫療法的整體特點。

本實驗采用雞胚法3種給藥方式觀察中藥復方合劑的抗病毒效果，方式一（同時給藥）是驗證藥物對病毒的直接滅活作用；方式二（預防給藥）是驗證藥物對病毒入侵的阻斷作用；方式三（治療給藥）是驗證藥物對病毒增殖的抑制作用；結果表明，中藥復方合劑3種給藥方式對雞胚均有一定的保護作用，但是程度有所不同，250 mg/mL時雞胚存活率為100%，與病毒對照組比較，差異有統計學意義；流感病毒抑制結果顯示，同時給藥、預防給藥和治療給藥方式的藥物濃度在62.5、125.0、250.0 mg/mL時表現有抗病毒活性，對甲型H1N1流感病毒均有抑制作用，并在安全濃度范圍內，呈現一定的量效關系，且同時給藥方式抗病毒作用強于其他兩組。由此可見，中藥復方合劑對H1N1流感病毒的防治雖以非特異性為主，但因通過機體免疫保護宿主，強調辨證，因而具有廣泛的適應性，為臨床抗病毒用藥提供了實驗依據。